۱۱ آبان ← چهاردهمین تزریق با وزن تقریبی ۲۴۵ گرم .
۱۸آبان ← پانزدهمین تزریق با وزن تقریبی ۲۵۰ گرم .
۲۵ آبان ← شانزدهمین تزریق با وزن تقریبی ۲۵۰ گرم .
۲ آذر ← هفدهمین تزریق با وزن تقریبی ۲۵۰ گرم .
۹ آذر ← هجدهمین و اخرین تزریق با وزن تقریبی ۲۶۰ گرم .
از این تاریخ تزریق هفتگی رتها بر طبق پروتوکل ۱۸هفتگی قطع گردید و برای حیوانات به مدت دو ماه تیمار و نگهداری برنامه ریزی شد که به اختصار در زیر می اید .

از تاریخ ۹ آذر تا ۱۲ بهمن روند نگهداری بدون تزریق رت ها آغاز گردید . در این مرحله به علت
سرمای هوا از روش های مختلفی جهت تامین گرمایش رت ها استفاده شد . نظیر قرار دادن بخاری در نزدیکی محل قفس ها ، قرار دادن ظرف های آب بر روی بخاری ها که با تبخیر آب از آن ها محیطی مطبوع را برای رت ها فراهم می آورد که به منظور جلوگیری از تضعیف سیستم ایمنی و درگیری حیوانات با بیماری های فصل سرما که منجر به اختلال در روند تحقیق می گردید الزامی می نمود .
در طول این دو ماه تیمار حیوانات از غذا و آب بدون محدودیت و بر اساس نیاز هر گروه برخوردار بودند.
رسیدگی به نظافت ، بهداشت و محل نگهداری قفس ها از دیگر فعالیت های الزامی بودند که توسط گروه محققین و مسئولیت حیوان خانه دانشکده انجام گردید .
یکی از مسائل بسیار مهم در روند تیمار حیوانات از همان بدو ورود ، مسئله بستر آنها در درون قفس است . عدم رعایت استانداردهای لازم در بستر حیوانات می تواند منجر به درگیری های اندام های دست و پای حیوانات با انواع قارچ ها گردد . همچنین تجمع فضولات و دفعیات رت ها می تواند انواع انحراف های غذایی را منجر گردد و همچنین محیطی مناسب برای رشد انواع میکروب ها را منجر شود . از این روبررسی مسائل بهداشتی و تعویض بستر و فراهم نمودن جای مناسب برای زندگی رت ها از اولویت های گروه تحقیق بود .
به این منظور بستر حیوانات که تهیه شده از پوشال و خاک اره تمیز از پسماندهای کارگاه های نجاری بود، هر هفته تعویض شده و بستری جدید و عاری از آلودگی ها برای رت ها تامین گردید . که توجه به این امر موجب به کاهش تلفات و درگیری های جانبی از بیماری های گوناگون در رت ها شد که قابل ذکر است .
از نکات دیگر تهیه اب مورد نیاز حیوانات بود . از ان جایی که آب لوله کشی دانشکده دامپزشکی گرمسار حاوی مقادیر زیادی املاح و نمک هاست و این املاح بیم این را می داد که در روند ازمایش ایجاد بیماری های نا شناخته در حیوانات را بکنند . از این رو آب تصفیه آشامیدنی برای رت ها روزانه تامین می گردید و در ظرف های مخصوص آب خوری بدون محدودیت در اختیار حیوانات قرار گرفت .
« تهیه غذای حیوانات در کارگاهی جداگانه صورت می گرفت که در قسمت بعدی مورد بررسی قرار می گیرد . »
از نکات قابل توجه دیگر در روند تیمار رت ها ، بررسی میزان وجود غذا در هر یک از قفس هاست . این مسئله باید روزانه توسط محقق مورد ملاحظه قرار گیرد زیرا عدم توجه به تمام شدن غذا در قفس ها و بی غذا ماندن حیوانات روندی غریزی را در آن ها شکل می دهد . بر این اساس رت های قوی تر به رت ضعیف تر قفس خود حمله می کنند و ضمن کشتن رت اقدام به تغذیه از گوشت حیوان مرده می کنند . این اتفاق علاوه بر اینکه از رت های مورد ازمایش می کاهد و ایجاد تلفات می کند ، می تواند منجر به بروز بیماری ها به علت تغذیه از گوشت حیوان هم نوع گردد . همچنین فساد گوشت نیز خود می تواند عاملی برای بروز بیماری گردد . همچنین گوشت آلوده محلی مناسب برای رشد میکروب های گوناگون است که این نیز به نوبه خود بیماری های واگیر را در رت های گروه آزمایش منجر می گردد که باید مورد ملاحظه قرار گیرد .
از دیگر نکات قابل توجه قرار دادن تعداد مناسبی رت در هر قفس بر اساس وزن و اندازه هر حیوان است . چنانکه این حیوانات در طول پروسه نگهداری به سرعت رشد می کنند وکمبودجا برای حرکت در قفس می تواند بیماری های اندام های حرکتی را برای آنها به دنبال آورد .
از این رو توجه به محل نگهداری رت ها مجددا و در طی رشد رت ها باید مورد ارزیابی و اصلاح قرار گیرد .
در طول روند تیمار بهتر است رت هایی که در هر قفس از لحاظ وزنی و جثه کوچکتر مانده اند جدا گردند و در قفسی جداگانه نگهداری شوند که در طول روند تحقیق مورد آزار و اذیت و زخمی شدن از سوی رت های هم گروه قرار نگرفته و بتوانند نیازهای غذایی خود را در محیطی جداگانه تامین کنند از این رو بعد از رسیدن به اندازه مناسب می توانند به قفس قبلی بازگردانده شوند .
رت ها حیواناتی هستند بسیار حساس در مقابل انسان . از این رو مراقبت از نزدیک شدن و برخورد با آنها در هنگام تیمار و تزریقات بسیار برای سلامتی انسان مهم است . استفاده از روش های مفید کردن در هنگام تزریقات و انجام کارهای تیماری در زمان کوتاه با حفظ شرایط ایمنی و پوشیدن دستکش های مخصوص الزامی است .
همچنین بیماری های مشترکی بین این حیوانات و انسان وجود دارد که توجه به این امر برای سلامتی حیوان و انسان قابل تامل و واجد احتیاط و کنترل می باشد . از این رو استفاده از وسایل پیشگیرانه از انتقال بیماری ها برای افراد مرتبط با رت ها الزامی است .
در تاریخ ۱۱ بهمن ، یکی از رت هااز گروه کنترل + یعنی گروه ۱ را باز کردیم ، تا اثرات القای سرطان در آنها مشاهده گردد . رت انتخاب شده از لحاظ ظاهری دارای سلامتی کامل بود و حدود ۳۳۰ گرم وزن داشت .
بعد از کالبد گشایی حیوان و باز کردن روده بزرگ ، توده ای به اندازه ماکروسکوپیک ۰/۵ cm × ۰/۵cm مشاهده شد .
سپس روده را در متیلن بلور رنگ آمیزی کرده و زیر میکروسکوپ مشاهده کردیم . مشاهده ضایعات پیش سرطانی نشان داد که پروسه القا سرطان به خوبی صورت گرفته است ، اما از آنجایی که هدف در این تحقیق تنها بررسی ضایعات پیش رونده سرطانی نبود و می باید تومور بدست می آوردیم از این رو تصمیم گرفته شد که رت ها به زمان ، یک ماه دیگر مورد تیمار قرار گیرند تا احیانا میزان تومورهای بیشتری به صورت ماکروسکوپیک نیز دیده شوند .
تیمار برای یک ماه دیگر برنامه ریزی شد و در این مدت تصمیم بر آن شد که چون دوره ایجاد سرطان و خوراندن سیاه دانه به مدت ۶ ماه در پروتکل توصیه شده بود . از این رودر مدت یک ماه تیمار اضافی که به رت ها اجازه رشد بیشتر می دادیم تا ضایعات پیش سرطانی احیانا به تومور تبدیل شوند ، غذای استاندارد موش تولید شده در انستیتو پاستور ایران مصرف گردد .
بالاخره در تاریخ ۱۲ اسفند ماه ، نمونه گیری از رت ها شروع شد.
یک ماه نگهداری بیشتر در بررسی های بعدی نشان داد که مفید بوده و تومور های بیشتری در نمونه گیری ها بدست آمد .
« شرح کامل نمونه گیری و جداسازی روده در قسمت های بعدی به تفضیل مورد بحث قرا می گیرد . »
۲-۲-نمونه گیری:
۲-۲-۱ - نمونه گیری بافت های کولون
از تاریخ ۱۲ اسفند و به مدت یک هفته به صورت مستمر کالبد گشایی و نمونه گیری ها در کلینیک دانشکده دامپزشکی انجام گردید .
مواد و وسایل لازم :
اتر ، دسیکاتور ، سرنگ انسولینی ، هپارین ، پنس ، قیچی جراحی ، تامپون ، پنبه
ابتدا مقداری پنبه را به اتر آغشتهمی کنیم و ان را در دسیکاتور قرار می دهیم . در دسیکاتور را بسته تا محیطی اماده برای تاثیر اتر بر روی حیوان ایجاد گردد . رت را از قفس بیرون آورده ، درون دسیکاتور گذاشته و در دسیکاتور حاوی پنبه آغشته به اتر را می بندیم . بعد از دو دقیقه حیوان بی هوش به درون دسیکاتور می افتد .
رت را از درون دسیکاتور در آورده ، به کمر می خوابانیم و دست و پای حیوان را در منتهی الیه بدن می کشیم . پنبه ای را حاوی کمی اتر می کنیم و بر روی دهان و بینی قرار می دهیم . پوست روی سینه حیوان را باز می کنیم ، دیافراگم دیده می شود ، آن را پاره می کنیم بعد از پاره شدن دیافراگم قلب نمایان می گردد . اکنون به وسیله سرنگ آغشته شده به هپارین از قلب خونگیری می کنیم .
( برای آغشته کردن سرنگ به هپارین ، کافی است که فقط هپارین را به درون سرنگ بکشیم و سپس به درون ظرف هپارین خالی می کنیم . این کار به منظور جلوگیری از انعقاد خون هنگام خونگیری از قلب ، جهت آزمایشات خونی بعدی صورت می گیرد . )

• • بعد از خون گیری از قلب ، تقریبا قلب از تپش باز می ایستد و حیوان بدون درد کشته شده است . حال برای انجام آزمایشات خود نیاز به نمونه گیری از روده داریم .

ـ طرز تهیه بافر فرمالین ۱۰ درصد: ۶/۴ گرم از NaH₂PO₄ با ۳۸/۱۶ گرم از Na₂HPO₄ در ml100 فرمالین  حل گردید و با آب مقطر به حجم ۱ لیتر رسانده شد.
۶ ماه بعد از شروع تیمار حیوانات، رت ها کشته شدند و بافت کولون آنها برای بررسی های هیستوپاتولوژیک جدا شد. تعداد کل تومورها در کولون شمارش شدند. و ابعاد هر تومور به دقت توسط کولیس اندازه گیری شد.
همچنین برای بررسی میکروسکوپی بافت ها بلافاصله بعد از بیرون آوردن کولون، یک برش طولی از سکوم تا آنوس در روده زده شد و در محلول PBS شسته شد.
۲-۲-۲- نمونه گیری بافت کبد
کبد رت ها جدا شده و در نرمال سالین سرد شسته شده و در فویل آلومینیوم در فریزر۸۰ – قرار داده شد.

۲-۳- آماده سازی نمونه و انجام آزمایشات بیوشیمی

۲-۳-۱-جداسازی میکروزوم و سیتوزول از بافت کبد و کولون

۲-۳-۱-۱-تهیه هموژن بافت کبد و کولون

- طرز تهیه محلول‌های مورد نیاز
ـ طرز تهیه بافرفسفات سالین PBS (3/7=pH)
۸ گرم NaCl ، ۲/۰ گرم KCl، ۴۴/۱ گرم  ، ۲۴/۰ گرم  در بالن ژوژه ۱ لیتری ریخته و حجم آن با آب مقطر به ۱ لیتر رسانده شد. سپس pH محلول به ۲/۷ تا ۴/۷ رسانده شد.
- روش کار
برای تهیه هموژن ۲۰ درصد (W/V) از بافت کبد و کولون، ۴/۰ گرم از بافت در یک استوانه مدرج مناسب قرار داده شد و روی آن PBS سرد (۳/۷=pH) تا حجم ۲ میلی لیتر ریخته شد. سپس مخلوط فوق داخل لوله مخصوص دستگاه هموژنایزر ریخته شد و محتویات لوله با حدود ۷ـ۵ بار بالا و پایین کردن هموژن گردید. زمان صرف شده برای هموژنه کردن تمام نمونه ها باید تقریباً با هم مساوی باشد.