۱-۵ گندزدایی سطحی ریزنمونه ها
با توجه به نمودار۱-۴، مطلوب ترین تیمارها برای گندزدایی بذور گیاه گل بنفشه رقمL. Viola odorata، تیمار سوم (الکل اتیلیک ۷۰ درصد به مدت ۳۰ ثانیه و هیپوکلریت سدیم ۵ درصد به مدت ۵ دقیقه) و تیمار چهارم (الکل اتیلیک ۷۰ درصد به مدت ۱دقیقه و هیپوکلریت سدیم ۵ درصد، به مدت ۵دقیقه) بود. بذرهای گیاهی به طور طبیعی با آلودگی همراه می­باشند. کاربرد ترکیبات ضدعفونی کننده مانند الکل اتیلیک و هیپوکلریت سدیم موجب کاهش آلودگی‏های سطحی ریزنمونه می­ شود ولی تاثیر چندانی بر عوامل آلوده کننده داخلی اندام گیاهان ندارند (دانشور، ۱۹۹۲). گائوراج و اوداگیری (۲۰۱۱) برای ضدعفونی اولیه ریزنمونه های دمبرگ ابتدا به مدت ۱۰-۵ دقیقه ریزنمونه ها را با مایع ضد­عفونی کننده (پریل ۵%v/v) پیش تیمار شدند و سپس دو تا سه مرتبه با آب جاری شستشو دادند. برای ضد عفونی مرحله اصلی از الکل اتیلیک ۷۰ درصد و هیپوکلریت سدیم استفاده شد. کاربرد الکل اتیلیک بین۳۰ ثانیه تا ۶۰ ثانیه در کاهش آلودگی بذرهای گل بنفشه موثر بود. برای ضد عفونی سطحی مواد گیاهی معمولا از الکل اتیلیک ۷۰ درصد استفاده می شود، زیرا الکل اتیلیک ۹۶ درصد باعث دهیدراته شدن بافت گیاهی می شود. الکل اتیلیک تنها بخشی از میکروارگانیسم ها را از بین می­برد و بعد از آن باید یک ضدعفونی کننده دیگر مثل هیپوکلریت سدیم یا کلسیم استفاده شود. الکل اتیلیک لایه کوتیکولی سطح ریزنمونه را در خود حل نموده و موجب جذب بهتر ماده ضدعفونی می­ شود. هیپوکلریت سدیم در واکنش با آب، کلر آزاد می­ کند که موجب بهم زدن ساختار سلولی میکروارگانیسم­ها می­ شود. (اثنی عشری و زکایی خسروشاهی، ۱۳۸۸). نعیم و همکاران (۲۰۱۳) برای ضد عفونی ریزنمونه­های گیاهی برگ، ساقه و دمبرگ گیاه گل بنفشه رقم Viola odorata از الکل اتیلیک ۷۰ درصد به مدت ۱ دقیقه و هیپوکلریت سدیم ۵ درصد به مدت ۸ تا ۱۰ دقیقه استفاده کردند. گائوراج و اوداگیری (۲۰۱۱) ریزنمونه‏های دمبرگ گیاه Viola patrinii را به مدت ۲ تا ۳ دقیقه در الکل اتیلیک ۸۰ درصد فرو بردند و برای شستشوی سطحی از کلرید جیوه ( (HgCl₂1/0 درصد ۲ الی ۳ دقیقه استفاده کردند.

نتایج اثر نوع تیمار گند زدایی نشان داد که کمترین درصد آلودگی (صفر درصد) در تیمارهای سوم (الکل اتیلیک ۷۰ درصد به مدت ۳۰ ثانیه و هیپوکلریت سدیم ۵ درصد به مدت ۵ دقیقه) و تیمار چهارم (الکل اتیلیک ۷۰ درصد به مدت ۱دقیقه و هیپوکلریت سدیم ۵ درصد، به مدت ۵ دقیقه ) مشاهده شد و بیشترین درصد آلودگی (۴۰ درصد) مربوط به تیمار اول (الکل اتیلیک ۷۰ درصد به مدت ۳۰ ثانیه و هیپوکلریت سدیم ۵ درصد به مدت ۳دقیقه) بود (نمودار۱-۴). آتسوشی و همکاران (۲۰۰۲) گزارش دادند که برگ‌های نابالغ Viola odorata را با الکل اتیلیک ۷۰% به مدت یک دقیقه و هیپوکلریت سدیم ۱ درصد به مدت ۱۵ دقیقه برای گندزدایی ریزنمونه­ها استفاده کردند.
۲-۵ جوانه زنی بذر
در بررسی غلظت های مختلف MS بر درصد جوانه زنی بذرها، آنالیز داده ها نشان داد که در غلظت ۱۰/۱ محیط کشت MS، بهترین درصد جوانه زنی با ۶۶/۸۸ درصد اتفاق افتاد درصورتی که در محیط کشت MS کامل، کمترین درصد جوانه زنی با ۶۶/۳۷ درصد مشاهده شد (نمودار ۲-۴). طبق این نتایج مشخص شد که با کاهش غلظت عناصر محیط کشت MS، رشد و جوانه زنی بذرها بهتر شد. همچنین مشاهده شد که به احتمال زیاد به دلیل بالارفتن غلظت عناصر محیط کشت و افزایش بیش اندازه نمک، پتانسیل آب کاهش یافته و دریافت آب و مواد غذایی توسط بذر دچار مشکل گردیده که در نهایت درصد جوانه زنی پائین آمده است. از طرف دیگر، به دلیل اینکه بذرهای گل بنفشه دارای خفتگی طولانی هستند، این پائین بودن غلظت عناصر می تواند به عنوان عامل تحریک جوانه­زنی بذرهای گل بنفشه باشد. جیان و من (۲۰۰۶) نیز برای جوانه زنی بذرهای گیاه Viola wittrockiana از محیط کشت MS با غلظت پائین استفاده کردند. آن ها در محیط کشت MS، ۴/۱ غلظت بذرها را رشد دادند.
در بررسی درصد جوانه زنی بذرهای گل بنفشه مشخص شد که بیشترین درصد جوانه زنی (۶۰درصد) در تیمار MS 1/10 قدرت همراه با ۵/۰ میلی­گرم در لیتر جیبرلین مشاهده شد (نمودار۳-۴). بذرهای بنفشه دارای خفتگی طولانی است بنابرین جوانه­زنی آن­ها کند است (زاهور و همکاران، ۲۰۱۲). جیبرلین از جمله تنظیم کننده­ های رشد است که در شکستن دوره خواب بذر نقش دارد. غلضت بالای جیبرلین در بذر، خواب بذر را شکسته و جوانه زنی آن را آسان می‏کند (پیریک،۱۹۷۶). تحقیقات نشان داده است که تنظیم کننده­ های رشد مثل جبرلین، به تنهایی یا در ترکیب با کاینتین باعث افزایش درصد جوانه زنی Viola odorata شدند (کانت لیف^[۲۵]، ۱۹۹۱و کارپنتر و بوچر^۲،۱۹۹۱). بهات و همکاران^۳ (۲۰۰۵) نشان دادند که گیاه مریم کوهیSwertia angustifoli از خانواده Gentianaceae با کاربرد جبرلین، جوانه زنی آن را تا ۹۶ درصد افزایش داد و کاهش میانگین طول دوره جوانه زنی را به دنبال داشت. در این آزمایش مشخص شد که جیبرلین در جوانه­زنی بذور تاثیر مثبت داشت که با نتایج بدست آمده همخوانی داشت.
دربررسی اثر شرایط نوری بر درصد جوانه زنی گیاه گل بنفشه دیده شد که بیشترین درصد جوانه زنی بذرها مربوط به تیمار تاریکی با ۵/۵۲ درصد بود (نمودار۴-۴). بعضی از بذرها برای جوانه زنی نیاز به تاریکی دارند که این در بذر کاهو و چند دسته دیگر از گیاهان مشاهده شده است. بنفشه نیز از جمله گیاهانی است که برای جوانه زنی بهتر باید در معرض تاریکی باشد که نتایج حاصله نشان دهنده این نکته می­باشد (حکمتی، ۱۳۸۲).
۳-۵ تولید کالوس
در بررسی تولید کالوس از ریزنمونه های برگ، دمبرگ و ساقه گیاه گل بنفشه با بهره گرفتن از تنظیم کننده رشد NAA به همراه BAP، مقدار بسیار کمی کالوس همراه با ریشه‏های فراوان تولید کردند و یا هیچ گونه کالوس تشکیل نگردید. برای تشکیل کالوس یک نسبت معین از اکسین به سایتوکنین مثلا ۱۰ به ۱ نیاز می­باشد و حفظ این تعادل در القاء و تشکیل کالوس حائز اهمیت است (دانشور، ۱۹۹۲). هورمون NAA از جمله اکسین­های قوی است. احتمالا به علت قوی بودن این هورمون و به هم خوردن تعادل نسبت اکسین به سایتوکنین، و بالا رفتن بیش اندازه غلظت اکسین در محیط کشت، القاء کالوس زیاد موفقیت آمیز نبود. جیان و من (۲۰۰۶) بیان کردند که کالوس‏های گیاه بنفشه بعد از تشکیل خیلی سریع ریشه می‏دهند. از آنجایی که هورمونNAA از جمله هورمون‏های موثر در ریشه زایی است، همان مقدار کالوس تشکیل شده اولیه، بلافاصله شروع به تولید ریشه کرده و روند کالوس زایی متوقف می‏شود. همچنین در نتیجه ای که توسط کومار و کانوار ^[۲۶] (۲۰۰۶) در همین زمینه انجام شده است. آن‌ها مشاهده کردند که کالوس‌های برگ گیاه ژربرا درمحیط کشت دارای NAA ریشه دار شدند. همچنین گائوراج و اوداگیری (۲۰۱۱) گزارش دادند در غلضت‏های بالای NAA و BAP هیچ پاسخی در برابر تشکیل کالوس مشاهده نکردند. این آزمایش با آزمایش اسوات و چادهاری^[۲۷] (۲۰۰۲) مطابقت نداشت، آن­ها بیشترین کالوس را از برگ­های ژربرا در محیط کشت MS همراه با هورمون‏های NAA و BAP بدست آوردند.
در بررسی القاءکالوس گیاه گل بنفشه با بهره گرفتن از تنظیم کننده رشد ۲,۴-D به همراه BAP، بیشترین وزن کالوس (۵۴/۰ گرم) در محیط کشت MS حاوی ۱ میلی­گرم در لیتر ۲,۴-D تولید شد. و بعد از آن در محیط کشت MS همراه با ۲ میلی­گرم در لیتر ۲,۴-D + 5/0 میلی­گرم در لیترBPA بیشترین وزن کالوس (۴۵/۰ گرم) حاصل گردید (نمودار۵-۴). نتایج نشان دادند که با کاهش میزان ۲,۴-D میزان تشکیل کالوس کاهش یافت. همچنین مشاهده شد در محیط کشت MS بدون تنظیم کننده رشد، کالوس تشکیل نشد. این نتایج نشان داد که در تشکیل کالوس وجود اکسین ضروری است و در محیط‏های کشت بدون اکسین، کالوس تشکیل نمی­ شود. این نتایج با نتایج آتاک و سلیک^[۲۸] (۲۰۰۹) مطابت داشت. آنها به تولید کالوس از برگ‏های ژربرا با بهره گرفتن از ترکیب هورمون ۲,۴-D وBAP دست یافتند. جیان و من (۲۰۰۶) نشان دادند که اکسین برای بالا بردن القاء کالوس لازم است و هورمون ۲,۴-D اثری بیشتری در تشکیل کالوس نسبت به IBA داشت. آن‏ها در محیط کشت MS با ۵/۰ میکرومول در لیتر ۲,۴-D + 9/8 میکرومول در لیتر BAPبه ۱۰۰ درصد تشکیل کالوس رسیدند و عنوان کردند که غلضت بالای BAP اثر بازدارنده بر تشکیل کالوس دارد.
در بررسی نتایج نوع ریزنمونه بر وزن کالوس تشکیل شده از گیاه گل بنفشه مشاهده شد، نوع ریزنمونه در نتایج تولید کالوس موثر است و بیشترین وزن کالوس (۴۶/۰ گرم) از ریزنمونه دمبرگ حاصل شد. (نمودار۶-۴ الف). نتایج این آزمایش با نتایج آزمایش گائوراج و اوداگیری (۲۰۱۱) مطلابقت داشت. آن­ها بیشترین وزن کالوس تولید شده را از ریزنمونه دمبرگ Viola patrinii دریافت کردند. همچنین نتایج نشان داد، کمترین میزان تشکیل کالوس از ریزنمونه برگ حاصل شد. جیان و من (۲۰۰۶) هر چند که تفاوت معنی داری در میزان کالوس حاصل از ریزنمونه‏های برگ و دمبرگ Viola wittrockiana مشاهده نکردند ولی گزارش دادند که کالوس‏های حاصل از برگ قهوه ای و کم حجم بودند که تولید ریشه می‏کردند و از نظر کیفی نسبت به کالوس‏های دمبرگ ضعیف­تر بودند.
نتایج اثر برهمکنش نوع ریزنمونه و نوع محیط کشت القاء کالوس نشان داد که بیشترین میزان کالوس (۷۶/۰ گرم) در محیط کشت MS همراه با ۲ میلی­گرم در لیتر ۲,۴-D + 5/0 میلی­گرم در لیترBPA از ریزنمونه دمبرگ حاصل شد (نمودار۶-۴ب). گائوراج و اوداگیری (۲۰۱۱) بیشترین وزن کالوس تولیدی را از ریزنمونه دمبرگ در محیط کشتMS همراه با ۴۴/۱۳ میکرومول در لیتر NAA + 33/13 میکرومول در لیتر BA بدست آوردند. نعیم و همکاران گزارش دادند که نتایج القاء کالوس در ریزنمونه‏های برگ، دمبرگ و ساقه Viola odorata متفاوت بود.
۴-۵ باززایی از کالوس
یکی از عوامل مهم برای ایجاد یک باززایی موثر و موفقیت آمیز، تشکیل و تولید کالوس باکیفیت به مقدار مناسب است. کالوس­های حاصل از ریزنمونه­های دمبرگ و ساقه گیاه گل بنفشه در مرحله اول کشت دارای کیفیت و انسجام ساختاری ضعیفی می­باشند که باید برای رشد بیشتر و کیفیت بهتر زیر کشت شوند. شرایط لازم برای رشد کالوس (محیط رشد، عوامل فیزیکی موثر در رشد) معمولا مشابه با شرایط لازم برای القای تشکیل کالوس می­باشد، با این تفاوت که غلضت اکسین و سیتوکنین کمتر است (پیریک،۱۹۷۶). به همین دلیل کالوس‏های حاصل از اولین مرحله کشت، به محیط کشت­های جدید زیرکشت شدند. این عمل زیر کشت ۲ بار انجام گرفت. محیط‏های کشت جدید حاوی ۲۵/۰ میلی گرم در لیتر IBA بودند. نتایج نشان داد که کالوس­های تولیدی بعد از زیر کشت شدن، دارای توانایی باززایی بالاتری نسبت به کالوس­های زیر کشت نشده بودند. زانگ و همکاران ^[۲۹](۱۹۹۳) و فانگ و همکاران^۲ (۲۰۰۰) به این نتیجه پی بردند که زیرکشت دوم روی کالوس برای باززایی موفقیت آمیز خواهد بود. همچنین نجیب و همکاران (۲۰۰۹) عنوان داشتند که زیرکشت کردن برای توسعه کالوس ها و باززایی شاخساره لازم است. جیان و من (۲۰۰۶) در باززایی بنفشه از کالوس گرفته شده از دمبرگ متوجه شدند که زیر کشت، برای باززایی شاخساره خیلی اهمیت دارد. آن­ها با مقایسه کالوس‏هایی که زیرکشت شدند بودند و کالوس‏هایی که بدون زیر کشت به محیط باززایی منتقل شده بودند، مشاهده کرند کالوس‏های زیر کشت نشده، بعد از انتقال به محیط کشت باززایی، ریشه دادند و باززایی شاخساره موفقیت آمیز نبود. نتایج مشابهی در بعضی از گونه‏های گیاهی توسط اسریکاندراج و همکاران^[۳۰]، ۱۹۸۲و گاریران و همکاران^۲، ۱۹۹۹ گزارش شده است.
۱-۴-۵ آزمایش اول باززایی
نتایج اثر نوع محیط کشت باززایی بر تعداد شاخساره تولید شده از کالوس حاصل از ریزنمونه برگ گیاه گل بنفشه نشان داد، بیشترین تعداد شاخساره (۹۴/۲ عدد) در محیط کشت MS همراه با ۱میلی گرم TDZ به دست آمد (نمودار ۸-۴). TDZ نسبت به سایرسایتوکنین‏هایی که استفاده شد خیلی قوی­تر عمل می­ کند (ناگنت و واردلی ریچاردسون،۱۹۹۱^۳). ساجید و فهیم^۴ در سال ۲۰۰۹ نشان دادند که وقتی TDZ در مقدار کم به محیط کشت اضافه شود خیلی موثرتر است. شاید به همین دلیل است که مقدار ۱ میلی­گرم در لیتر TDZ بهتر از مقدار ۲ میلی­گرم در لیتر TDZ در تشکیل شاخساره موثر بوده است. جیان و من (۲۰۰۶) نشان دادند که در محیط کشت MS همراه با ۵/۴ میکرومول در لیتر TDZ و ۰۲/۰ ( (w/vزغال فعال، بالاترین درصد باززایی (۹/۲۱ ٪) را به دست آوردند. در محیط کشت MS همراه با ۵/۰ میلی­گرم در لیتر Kin+ 5/0 میلی­گرم در لیتر BAP و محیط کشت MS همراه با ۱میلی­گرم در لیتر + Kin 5/0 میلی­گرم در لیتر BAP کمترین تعداد شاخساره (۱ عدد) مشاهده شد (نمودار۸-۴).
در بررسی برهمکنش نوع محیط کشت تولید کالوس و نوع محیط کشت باززایی بر تعداد شاخساره تولید شده از کالوس ریزنمونه برگ گیاه گل بنفشه مشاهده شد که بیشترین تعداد شاخساره (۴ عدد) با انتقال کالوس‏های تشکیل شده از محیط کشت MS حاوی ۵/۰ میلی­گرم در لیتر ۲,۴-D + 5/0 میلی­گرم در لیترBAP به محیط کشت باززایی MS همراه با ۱میلی­گرم در لیتر TDZ به دست آمد و بعد از آن بیشترین تعداد شاخساره (۸/۳ عدد) با انتقال کالوس‏های تشکیل شده از محیط کشت MS حاوی ۲ میلی­گرم در لیتر ۲,۴-D + 5/0 میلی­گرم در لیتر BAP به محیط کشت باززایی MS همراه با ۱میلی­گرم در لیترTDZ بود (جدول ۶-۴). نتایج نشان داد که محیط­های کشت‏ تولید کالوس همراه با اکسین و سایتوکنین، باززایی بهتری نسبت به سایر تیمارها نشان دادند. سایتوکنین­ها وقتی­که توام با یک اکسین استفاده شوند، باعث تحریک تقسم سلولی می­شوند (آماسیون^[۳۱]، ۲۰۰۵).
درمورد اثر نوع محیط کشت تولید کالوس برشاخص طول شاخساره تولید شده از کالوس حاصل از ریزنمونه برگ گیاه گل بنفشه نشان داد که بیشترین طول شاخساره (۲/۴ سانتی متر) در محیط کشت MS حاوی ۱میلی­گرم در لیتر ۲,۴-D + 5/0 میلی­گرم در لیتر BAP به دست آمد (نمودار۹-۴ الف). با توجه به نتایج بدست آمده مشخص شد در محیط‏های کشت تولید کالوس حاوی اکسین توفوردی و BAP، طول شاخساره بیشتربود. جیان و من (۲۰۰۶) گزارش کردند، BAP روی طویل شدن شاخساره‏های حاصل از باززایی موثر بود.
در بررسی برهمکنش نوع محیط کشت تولید کالوس و نوع محیط کشت باززایی بر طول شاخساره تولید شده از کالوس ریزنمونه برگ گیاه گل بنفشه مشاهده شد بیشترین طول شاخساره (۸۲/۶ سانتی متر) با انتقال کالوس حاصل از محیط کشت MS همراه با ۱ میلی­گرم در لیتر۲,۴-D + 5/0 میلی­گرم در لیتر BAP به محیط کشت باززایی MS همراه با ۱ میلی­گرم در لیتر TDZ به دست آمد (جدول ۷-۴ ). این نتایج نشان داد که محیط‏های کشت تولید کالوس که علاوه بر اکسین توفوردی حاوی BAP بودند، با انتقال به محیط کشت باززایی، طول شاخساره بیشتری، تولید کردند. احتمالا افزودن سیتوکنین در مرحله تولید کالوس، باعث تجمع سایتوکنین درونی سلول­های تمایز نیافته کالوس می­ شود که موجب می­گردد، کالوس در مرحله باززایی و تولید شاخساره بهتر عمل کند.
۲-۴-۵ آزمایش دوم باززایی
بیشترین تعداد و همچنین طولانی شدن طول شاخساره تولید شده از کالوس حاصل از ریزنمونه دمبرگ و ساقه گیاه گل بنفشه از ریزنمونه دمبرگ تولیدگردید (۱۰-۴ الف). این نتایج با نتایج ساتو و همکاران (۱۹۹۵) مطابقت داشت. آن‏ها از کالوس‏های گرفته شده از دمبرگ ویولای وحشی، باززایی شاخساره انجام دادند. اورلیکوکا و همکاران^[۳۲] (۱۹۹۹) عنوان داشتند که بخشی از شاخه زایی به نوع ریزنمونه ای که کالوس از آن حاصل می‏شود بستگی دارد. آن‏ها به باززایی ۶ شاخساره از هر قطعه کالوس حاصل از دمبرگ ژربرا دست یافتند.
در بررسی اثر نوع محیط کشت تولید کالوس بر تعداد شاخساره تولید شده از کالوس حاصل از ریزنمونه دمبرگ و ساقه گیاه گل بنفشه مشاهده شد بیشترین تعداد شاخساره (۲۳/۴ عدد) در محیط کشت MS همراه با ۵/۰ میلی­گرم ۲,۴-D + 5/0 میلی­گرم در لیترBAP به دست آمد (نمودار ۱۰-۴ ب). نتایج نشان داد که در محیط‏های کشت حاوی BAP، تعداد شاخساره بیشتر از سایر محیط‏های کشتی بود که فقط حاوی اکسین بودند. وجود سایتوکنین در محیط کشت بر روی شاخه زایی اثر مثبت داشت. این نتایج با نتایج نجیب و همکاران (۲۰۰۹) مطابقت داشت. آن‌ها مشاهده کردند که افزودن BAP و توفوردی به محیط کشت موراشیک و اسکوگ، روی تولید کالوس و باززایی گیاه موثر است.
نتایج بررسی اثر نوع محیط کشت باززایی بر تعداد شاخساره تولید شده از کالوس حاصل از ریزنمونه دمبرگ و ساقه گیاه گل بنفشه نشان داد بیشترین تعداد شاخساره (۹۶/۴ عدد) در محیط کشت MS همراه با ۵/۰ میلی گرم در لیتر TDZ + 1/0 میلی­گرم در لیتر NAA تولید شد. بعد از آن تیمار محیط کشت ۱ میلی گرم در لیترTDZ دارای بیشترین تعداد شاخساره بود (۵۶/۴ عدد) (نمودار۱۰-۴ ج). طبق این نتایج مشاهده شد که در محیط‏های کشت حاوی TDZ، باززایی با نسبت خوبی انجام گرفت و در محیط‏های بدون TDZ، باززایی با نسبت پائینی اتفاق افتاد که کمترین میزان باززایی در محیط کشت MS همراه با ۵/۰میلی­گرم در لیتر Kin + 5/0 میلی­گرم در لیتر BAP(58/1 عدد) صورت گرفت. (نمودار۱۰-۴ ج). این نتایج با نتایج وانگ و من^[۳۳] (۲۰۰۶) مطابقت داشتند. آن‏ها گزارش دادند موفقیت در شاخه زایی و هم چنین، طول و تعداد آن به وجود TDZ همراه با سایر هورمون‏ها بستگی دارد. هاتمن و پرس^۳ (۱۹۹۳) عنوان کردند تیدارزرون با تحریک سیتوکنین­های درون زا گیاه، موجب تحریک و شاخه­زایی در گیاه می­گردد. همچنین نتایج این آزمایش نشان داد که کاربرد اکسین NAAدر کنار TDZ تاثیر خوبی در باززایی شاخساره داشت. هازبولا و همکاران^[۳۴] (۲۰۰۸) گزارش دادند که افزودن اکسین، در کنار سایتوکنین­ها برای القای شاخساره در ژربرا لازم است.
در بررسی برهمکنش نوع ریزنمونه و نوع محیط کشت تولید کالوس برتعداد شاخساره تولید شده از کالوس حاصل از ریزنمونه‏های دمبرگ و ساقه گیاه گل بنفشه مشاهده شد، بیشترین تعداد شاخساره (۷۱/۴ عدد) از ریزنمونه دمبرگ در محیط کشت MS به همراه ۵/۰ میلی­گرم در لیتر ۲,۴-D + 5/0 میلی­گرم در لیتر BAP تولید شد و کمترین تعداد شاخساره (۷۲/۱) در محیط کشت MS همراه با ۵/۰ میلی­گرم در لیتر ۲,۴-D بدونBAP اتفاق افتاد (نمودار۱۰-۴ د). زاهور و همکاران (۲۰۱۲) با محیط کشت MS همراه با ۱۵ میکرومولار BAP و ۱۵ میکرومولار Kin به بهترین نتیجه تعداد شاخساره را نشان دادند. آن‏ها مشاهده کردند که با افزایش غلظت BAP از ۵ میکرومولار به ۱۵ میکرومولار، تعداد شاخساره به طور معنی­داری افزایش یافت.
نتایج اثر نوع محیط کشت تولید کالوس بر طول شاخساره تولید شده از کالوس حاصل از ریزنمونه دمبرگ و ساقه گیاه گل بنفشه نشان داد، بیشترین طول شاخساره در محیط کشت MS همراه با ۱ میلی­گرم در لیتر ۲,۴-D + 5/0 میلی­گرم در لیتر BAPبه دست آمد. همچنین مشاهده شد، کمترین طول شاخساره در محیط کشت MS همراه با ۵/۰ میلی­گرم در لیتر ۲,۴-D بدون BAP صورت گرفت (نمودار ۱۱-۴ ب). این نتایج نشان داد که در محیط‏های کشت حاوی BAP، طول شاخساره نسبت به سایر محیط‏های کشت بیشتر بود. دانشور (۱۹۹۲) و لاکشمی سیت^۳ (۱۹۹۳) اثر مثبت کاربرد سیتوکنین­ها بر شاخه زایی در گیاهان مختلف را تائید کردند.
در بررسی اثر نوع محیط کشت باززایی بر طول شاخساره تولید شده از کالوس حاصل از ریزنمونه دمبرگ و ساقه گیاه گل بنفشه مشاهده شد که بلندترین شاخساره (۲۳/۵ سانتی متر) در محیط کشت MS همراه با ۵/۰ میلی گرم در لیتر TDZ + 1/0 میلی گرم در لیتر NAA تولید شد (نمودار ۱۱-۴ ج). این نتایج نشان داد که TDZ تاثیر خوبی بر طول شاخساره داشت. در محیط‏های دارای TDZ طول شاخساره نسبت به سایر محیط‏ها بیشتر بود به طوری­که کمترین طول شاخساره در محیط کشت بدون TDZ اتفاق افتاد. محیط کشت MS همراه با۱ میلی­گرم در لیتر Kin + 5/0 میلی­گرم در لیتر BAP کمترین طول شاخساره ( ۴۶/۱ سانتی­متر) داشت. سونی و کور^[۳۵] (۲۰۱۳) گزارش دادند حضور ۵/۰ میلی­گرم در لیتر TDZ در محیط کشت MS همراه با ۵/۰ میلی­گرم در لیتر BAP و ۵/۰ میلی­گرم در لیتر جیبرلین، تاثیر خوبی در تشکیل شاخساره از جوانه­های Viola pilosa داشت.
در بررسی برهمکنش نوع ریزنمونه و نوع محیط کشت باززایی برطول شاخساره تولید شده از کالوس حاصل از ریزنمونه‏های دمبرگ و ساقه گیاه گل بنفشه نیز مشاهده شد، بیشترین طول شاخساره (۵۹/۵ سانتی متر) در محیط کشت MS همراه با ۵/۰ میلی­گرم در لیترTDZ + 1/0 میلی­گرم در لیتر NAA بود که از ریزنمونه دمبرگ حاصل شد (نمودار ۱۲-۴ ). در این نتایج مشاهده شد که ترکیب TDZو NAA افزایش معنی­داری در شاخه زایی از کالوس­های دمبرگ داشت که این با نتایج ناگنت و واردلی ریچاردسون ( ۱۹۹۱) مطابقت داشت. پیریک و همکاران (۱۹۷۳) گزارش دادند که افزودن یک اکسین قوی مانند NAA به محیط کشت باززایی، در تشکیل شاخساره خیلی موثر است.گائوراج و اوداگیری (۲۰۱۱) از کالوس‏های حاصل از دمبرگ ویولای وحشی شاخساره‏های ۷-۶ سانتی تولید کردند.
نتایج برهمکنش نوع محیط کشت تولید کالوس و نوع محیط کشت باززایی بر طول شاخساره تولید شده از کالوس حاصل از ریزنمونه‏های دمبرگ و ساقه گیاه گل بنفشه نشان داد بلندترین طول شاخساره با انتقال کالوس از محیط کشت MS همراه با ۱ میلی­گرم در لیتر ۲,۴-D به محیط کشت باززایی همراه با ۵/۰ میلی­گرم در لیتر + TDZ1/0 میلی­گرم در لیتر NAA بدست آمد (جدول ۱۰-۴).
۵-۵ ترکیب بهترین تیمار باززایی همراه با پوتریسین
پلی آمین ها به عنوان تنظیم کننده های رشد گیاهی در محدوده وسیعی از فرایندهای رشد و نمو، شامل تقسیم سلولی، رویان زایی و ریخت زایی مشارکت دارند (کائور-ساهنی و همکاران^[۳۶]،۲۰۰۳). پوترسین و پلی آمین‏های اسپرمیدین و اسپرمین ممکن است در تقیسم سلولی و رشد و نمو گیاه نقش داشته باشند (باگنی^۳، ۱۹۸۶، ِاوَنس و مامبرگ^[۳۷]، ۱۹۹۱، گالستون^۲، ۱۹۸۳). در این آزمایش اثر پوترسین برباززایی گیاه گل بنفشه بررسی شد. اثر پوترسین بر شاخساره نشان داد، بیشترین طول شاخساره (۱۴/۶ سانتی متر) در محیط کشت MS همراه با ۱میلی گرم بر لیترTDZ + 100میلی گرم در لیتر پوتریسین مشاهده شد که با سایر تیمارها از لحاظ آماری اختلاف معنی­داری داشت (نمودار۱۴-۴). این نتایج با نتایج تیروونگدام و همکاران^۳ (۲۰۱۲) مطابقت داشت. آن­ها وجود پلی آمین­ها در محیط کشت باززایی را موثر دانستند. بسای و متا^۴ (۱۹۸۵) نیز نقش پلی آمین­ها در باززایی شاخساره از برگ­های Passiflora sp. را تائید کردند. همچنین در این آزمایش بیشترین تعداد شاخساره در غلضت ۱۰۰ میلی­گرم در لیتر پوتریسین به همراه ۱ میلی­گرم در لیتر TDZ مشاهده شد که البته این با سایر غلضت‏های پوتریسین تفاوت معنی داری نداشت. (نمودار۱۳-۴).
۶-۵ ریشه زایی
در بررسی بین پنج محیط کشت ریشه زایی، بیشترین تعداد ریشه و طول ریشه در محیط کشت MS همراه با ۱ میلی­گرم در لیتر NAA + 1/0 میلی­گرم در لیترIBA تولید شد و کمترین تعداد ریشه در محیط کشت MS بدون تنظیم کننده رشد مشاهده شد (نمودار۱۵-۴ و نمودار ۱۶-۴). نتایج نشان داد که ترکیب هورمون NAA با IBA نتیجه بهتری در تعداد ریشه و طول ریشه داشت تا زمانی که از هورمون NAA به تنهایی استفاده شد. همچنین مشاهده شد که با افزایش غلضت هورمون NAA، تعداد ریشه بیشتری تولید شد. پیریک و همکاران (۱۹۸۴) نشان دادند که NAA سبب تسریع در ریشه دهی گیاهچه­ها در گیاهان خانواده آناناس می شود. گائوراج و اوداگیری (۲۰۱۱) گزارش دادند که گیاهچه­های بنفشه وحشی Viola patrinii)) با محیط کشت MS همراه با IAA و IBA دارای رشد و تعداد ریشه‏های متوسطی (۶۳ درصد) تولید شد. آن­ها در محیط­های کشت حاوی فقط IAA با غلظت ۷۱/۵ و ۴۲/۱۱ میکرومول در لیتر، تشکیل ریشه قابل توجهی را مشاهده نکردند.
۷-۵ سازگاری
از بین سه نوع بستر کشت، گیاهان رشد یافته در بستر کوکوپیت و پرلیت (۱:۱) بیشترین درصد زندمانی را نشان دادند. همچنین در بستر ترکیبی کوکوپیت و پرلیت گیاهک‏ها، شاخساره‏های بلندتری تولید کردند (نمودار ۱۷-۴ و نمودار ۱۸-۴). نتایج نشان داد که مخلوط کوکوپیت و پرلیت، تاثیر مثبتی نسبت به بسترهای جداگانه آن‏ها داشت. پرلیت به دلیل تخلل خوب و زهکشی و تهویه مناسب و کوکوپیت به دلیل اینکه ظرفیت نگه داری آب بیشتری دارد. در مجموع محیط مناسبی را برای رشد گیاهان در شرایط کشت بافت بوجود آوردند. پرلایت دارای طبیعت متخلخل است که به آن توان نگهداشتن مقداری آب می دهد و اندازه ذرات آن تهویه و زهکشی خوبی فراهم می کند. از اثرات مفید کوکوپیت این است که به دلیل داشتن اندازه کوچک ذرات، قدرت نگه داری آب بیشتری دارد ولی حالت غرقاب در گیاه ایجاد نمی کند زیرا خاصیت موئینگی در این ماده بالاست و بستر به تدریج آب خود را از دست می دهد (نوگرا و همکاران^[۳۸]، ۲۰۰۰). رشد و نمو گیاه به طور موثری با دسترس بودن فسفر در ارتباط است چون فسفر باعث افزایش طول ساقه گل می شود. گیاهان رشد یافته در بستر کشت کوکوپیت و پرلیت به نسبت (۱:۱) و کوکوپیت به علت pH پایین کوکوپیت عناصر ماکرو مخصوص فسفر و پتاسیم را به راحتی جذب می­ کنند و رشد بهتری نسبت به گیاهان رشد یافته در بستر پرلیت دارند (احمد و همکاران^۲،۲۰۱۲).
۸-۵ نتایج کلی
***نتایج کلی آزمایش گندزدایی بذرهای گل بنفشه نشان داد که بهترین تیمارهای ضدعفونی کننده بذرهای گل بنفشه رقم Viola odorata تیمار سوم (الکل اتیلیک ۷۰ درصد به مدت ۳۰ ثانیه و هیپوکلریت سدیم ۵ درصد به مدت ۵ دقیقه) و تیمار چهارم (الکل اتیلیک ۷۰ درصد به مدت ۱دقیقه و هیپوکلریت سدیم ۵ درصد، به مدت ۵دقیقه) بود که در هر دو تیمار درصد آلودگی بذرها صفر گزارش شد.
*** نتایج آزمایش درصد جوانه زنی نشان داد که بذرهای گل بنفشه رقم Viola odorata در محیط کشت همراه با جیبرلین جوانه­زنی بهتری نسبت به محیط کشت عاری از جیبرلین داشتند. همچنین تیمار تاریکی نسبت به تیمار روشنایی در جوانه­زنی بذرها موثرتر بود.
*** در آزمایش القاء کالوس نتایج نشان داد که تنظیم­کننده رشد توفوردی نسبت به NAA در القاء و تولید کالوس از ریزنمونه­های گیاه گل بنفشه اثر بیشتری داشت و به طور کلی تیمار ۱ میلی­گرم در لیتر توفوردی بیشترین میزان کالوس را تولید کرد. همچنین ریزنمونه ساقه نسبت به ریزنمونه­های برگ و دمبرگ، تولید کالوس بهتری را نشان داد.
***در آزمایش باززایی گیاه گل بنفشه نشان داد که زیرکشت کردن کالوس­ها یک عامل مهم در باززایی گیاه گل بنفشه است. زیرا میزان و کیفیت کالوس تولیدی در مرحله اول کشت بسیار کم است و باید برای تولید بیشتر و با کیفیت­تر، کالوس­ها زیرکشت شوند. در این آزمایش بهترین باززایی شاخساره در محیط کشت ۱ میلی­گرم TDZ مشاهده شد و ریزنمونه دمبرگ، نسبت به ریزنمونه برگ و ساقه، باززایی بهتری را نشان داد. در ترکیب بهترین تیمار مرحله باززایی با پوترسین نیز به­ طور ­کلی بهترین باززایی در تیمار ۱۰۰ میلی­گرم در لیتر پوترسین همراه با ۱ میلی­گرم در لیتر TDZ مشاهده شد.
*** آزمایش ریشه زایی شاخساره­های تولیدی گیاه گل بنفشه نشان داد که ترکیب دو تنظیم کننده رشدNAA و IBA به ترتیب با غلظت­های ۱ و ۱/۰ میلی­گرم در لیتر در ریشه زایی شاخسارها، نتیجه بهتری را داشت. همچنین مشاهده شد که با افزایش تنظیم کنندهNAA تا غلظت ۱ میلی­گرم در لیتر، میزان ریشه دهی شاخساره ها افزایش یافت.
*** درسازگاری گیاهک های حاصل از ریزنمونه های گل بنفشه نتایج نشان داد، ترکیب دو بستر کشت کوکوپیت و پرلایت درصد زنده مانی بیشتر و طول شاخساره بلندتری را تا کاربرد مجزای هر یک از این بسترها، در پی داشت.
۹-۵ پیشنهادات:
***گیاه گل بنفشه یک گیاه دارویی –زینتی است و کاربرد زیادی در بحث زیباسازی مناظر شهرها دارد و از طرف دیگر در صنعت داروسازی هم از اهمیت زیادی برخوردار است، در حال حاضر، یک سوم داروهای مورد استفاده بشر را داروهای با منشاء گیاهی تشکیل می دهد. از این رو پیشنهاد می شود که آزمایش­های بیشتری در جهت تولید و تکثیر آن در حد انبوه و تجاری از طریق زمینه کشت بافت صورت گیرد تا بدین طریق میزان متابولیت­های ثانویه مانند فلاونوئیدها، آلکالوئید (ویولین)، روغن­های ضروری ( لینولنیک، هیدروکینون دی متیل اتر) و اسید سالیسلیک افزایش یابند.
***از آنجایی که در این تحقیق تنها یک رقم گیاه گل بنفشه جهت باززایی در نظر گرفته شد، پیشنهاد می شود که سایر رقم های این گونه و همچنین سایر گونه­ های جنس Viola مورد آزمایش قرار گیرند.
*** پیشنهاد می شود سایر تنظیم کننده­ های رشد اکسین و سیتوکنین در بررسی کالوس زایی و اندام­زایی آن مورد آزمایش صورت گیرد.
*** به دلیل زمان کم این پایان نامه، و پرهزینه بودن استخراج، خالص سازی و شناسایی متابولیت­های ثانویه این گیاه پیشنهاد می شود بخش دارویی این گیاه در تحقیقی دیگر مورد بررسی قرار گیرد.
منابع:
منابع:
۱-سیدطباطبایی، ب. ا. و امیدی، م. ۱۳۸۸. کشت بافت و سلول گیاهی. انتشارات دانشگاه تهران. ۳۶۸ص.
۲-ایوانز، دی.، کولمن، جی. او. دی و کرنز، ا. ۲۰۰۷. کشت یاخته گیاهی. مترجمان: محمود خسروشاهی و مهدی بهنامیان. انتشارات دانشگاه تبریز. ۲۷۷ ص.
۳-اثنی عشری، م. و زکائی خسروشاهی، م. ۱۳۸۸. راهنمای جامع کشت بافت گیاهی. انتشارات دانشگاه بوعلی سینا. ۴۸۵ص.
۴- چاولا، اچ. اس. ۱۳۸۲. اصول بیوتکنولوژی گیاهی. مترجمان: محمد فارسی و جعفر ذوالعلی. انتشارات دانشگاه فردوسی مشهد. ۴۹۵ ص.
۵- پیریک، آر. ال. ام. ۱۹۷۶. مبانی کشت بافت‏های گیاهی. مترجم: عبدالرضا باقری. انتشارات دانشگاه مشهد. ۴۰۶ص.
۶- پیری، خ. و نظریان فیروزآبادی، ف. ۱۳۸۵. راهنمای کشت بافت گیاهان. انتشارات دانشگاه بوعلی سینا. ۲۱۴ص.
۷- فرزاد، م. ع. ۱۹۳۱. گیاهان دارویی و معطر ایران. جلد اول. ۲۶۲ ص.
۸- مظفریان، و. ۱۳۷۹. رده بندی گیاهان (مورفولوژیکی-تاکسونومی). جلد اول. انشارات امیرکبیر تهران. ۵۰۱ ص.
۹- مظفریان، و. ۱۳۹۱. شناخت گیاهان دارویی و معطر ایران. ۱۳۵۰ ص.