شکل ۳-۱- تاثیر سن تلقیح بر روی رشد سلولی تولید بیوپلیمردر شرایط فرایند بیولوژیکی(T = 30°C، (shaking rate = 250 rpm
شکل ۳- ۲- تاثیر شدت هم زدن بر روی رشد سلولی تولید بیوپلیمردر شرایط فرایند بیولوژیکی(T = 30°C،(seed age = 12 h
شکل ۳- ۳- تاثیر دما بر روی رشد سلولی تولید بیوپلیمردر شرایط فرایند بیولوژیکی(shaking rate = 250 rpm ،(seed age = 12
۳-۱-۲- استفاده از گلوکز بعنوان تنها منبع کربن
شکل ۳-۴ استفاده از گلوکز بعنوان تنها منبع کربن را نشان میدهد. استفاده از گلوکز، سبب تولید مونومر هیدروکسیبوتیرات گردید. پس از گذشت ۴۸ ساعت از کشت، میزان گلوکز موجود در محیط g/l 22 بود بنابر این میزان قند مصرفی حدود g/l 18 و بیوماس تولیدی حداکثر g/l 32 بود و حداکثر بیوپلیمر تولیدشده به g/l 62/2 رسید. مطابق شکل، میزان بیوپلیمر تولیدی و همینطور وزن خشک سلولی بعد از گذشت ۵۰ ساعت از کشت به آرامی کاهش یافته است.
شکل ۳- ۴- بیوپلیمر تولیدشده(PHB) ومیزان رشد سلولی به ازای مصرف گلوکز به عنوان سوبسترا
این الگو در بیشتر مواردی که از منابع کربن بصورت جداگانه استفاده میگردد، مشاهده شده است. برای نمونه میتوان به مطالعه Anderson و Dawes، اشاره نمود. کاهش رشد و تولید پلیمر در نتیجه اسیدی شدن محیط است[۶۵]. در یکی از مطالعات با بهره گرفتن از میکروارگانیسم Alcaligenes eutrophus در محیط کشتی با غلظت g/l 20 گلوکز به تولیدی معادل g/l 97/0 بیوپلیمر دست یافتند که تمامی بیوپلیمر تولید هیدروکسیبوتیرات بود[۱۹]. در مطالعهای دیگر Ramsay و همکاران از گلوکز با غلظتی معادل g/l 30 استفاده کردند. پلیمر تولیدی در این مطالعه نیز، هیدروکسیبوتیرات بود[۲۰].
۳-۱-۳- استفاده ازفروکتوز بعنوان تنها منبع کربن
شکل ۳-۵ استفاده از فروکتوز بعنوان تنها منبع کربن را نشان میدهد. حداکثر وزن خشک سلولی[۷۲] معادل g/l 17 بود که از این میزان بیوماس تولیدی، g/l 7/1 پلیهیدروکسیبوتیرات حاصل گردید. تعیین میزان فروکتوز در محیط نشان داد که از g/l 40 فروکتوز اولیه در محیط کشت، میکروارگانیسم g/l 26 آنرا بمصرف رسانیده است. بموازات افزایش وزن خشک سلولی، تولید بیوپلیمر نیز افزایش یافته و پس از ۷۲ ساعت به حداکثر رسید. پس از این مدت شاهد افت ناگهانی تولید بودیم که دلیل این امر میتواند اسیدی شدن محیط باشد[۶۵].
شکل ۳- ۵- بیوپلیمر تولیدشده(PHB) ومیزان رشد سلولی به ازای مصرف فروکتوز به عنوان سوبسترا
در یکی از مطالعات ، با بهره گرفتن از فروکتوز به میزان ۴۰ گرم بر لیتر، بیوماسی معادل ۲۵/۳ و پلیهیدروکسیبوتیرات ۴/۱ گرم بر لیتر پس از گذشت ۴۸ ساعت بدست آوردند[۲۱].
۳-۱-۴- استفاده آب پنیر به عنوان منبع کربن
با توجه به این که تعداد محدودی از میکروا گانیسم ها قابلیت تبدیل لاکتوز به صورت مستقیم به پلی هیدروکسی آلکانوآتها را دارند[۲۳]. لذا در این مرحله آب پنیر[۷۳] هیدرولیز شیمیائی شد و سپس به عنوان بستر کشت استفاده شد.بعد از اضافه کردن اسید سولفوریک وتنظیم pH حدود ۴-۵/۴ ،آب پنیر به مدت ۱۰ دقیقه جوشانده شد.سپس محلول توسط صافی فیلتر شده داخل یخچال قرار گرفت.بعد از ۸ ساعت محلول از یخچال خارج شده ومحلول شفاف بالائی[۷۴] جدا شده وتوسط محلول ۵/۰ نرمال سود در pH 7/6 تنظیم شد. وبه عنوان محیط کشت فرایند بیولوژیکی مورد استفاده قرار گرفت.
شکل ۳- ۶- بیوپلیمر تولیدشده (PHB,PHV) ومیزان رشد سلولی به ازای مصرف آب پنیر
استفاده از آب پنیر جهت بستر کشت جهت تولیدبیوپلیمردر شکل ۳-۶ مشاهده می شود در این حالت حداکثر وزن خشک سلولی معادل g/l 16 بود که از این میزان بیوماس تولیدی،حدود g/l 9/1 پلیهیدروکسیبوتیرات و حدود g/l 7/ 2 پلی هیدروکسی والرات حاصل گردید. تعیین میزان قندهای احیاء شونده در محیط نشان داد که از g/l 40 قند اولیه در محیط کشت، میکروارگانیسم g/l 32 آنرا بمصرف رسانیده است.
.کالر و همکارانش طی مطالعه ای با بهره گرفتن از باکتری های H. mediterranei H. pseudoflava ,
-
- hydrogenovoraروند تولید پلی هیدروکسی آلکانوآتها را مورد بررسی قرار دادند .برای میکروارگانیسم های مذکور میزان تولیدکوپلیمر پلی هیدروکسی بوتیرات/هیدروکسی والرات به ترتیب ۱۲،۵۰ ، ۳۰ در صد وزن سلول خشک به ازای مصرف آب پنیر هیدرولیز شده بوده است که میزان بهره دهی حجمی آنها به ترتیب ۰۳/۰ ،۰۲/۰ و۱۶/ ۰ گرم بر لیتر بر ساعت بوده است. کالر وهمکران در تحقیق دیگری با بهره گرفتن از میکروارگانیسم P. hydrogenovoraتوانستند به ترتیب مقادیر ۲۷/۱ و ۴۴/۱ گرم برلیتر پلی هیدروکسی بوتیرات و پلی هیدروکسی والرات به دست آورند.در این تحقیق نیز با بهره گرفتن از میکرو ارگانیسم H. pseudoflava مقدار بیوپلیمر های به دست آمده با توجه به عدم استفاده از مکمل های آلی و معدنی با توجه به مقادیر به دست آمده توسط کالر وهمکاران، قابل توجه بوده است .
۳- ۲- میکروارگانیسم Cupriavidus necator DSM 545
Cupriavidus necator از میکرو ارگانیسم های شناخته شده است که قادر به تولید پلی هیدروکسی آلکانوآتها تا حد ۸۰ درصد وزن خشک سلولی می باشد.
۳-۲-۱-۱- بررسی شرایط فرایند بیولوژیکی
جهت دستیابی به شرایط مناسب فرایند بیلوژیکی تولید بیوپلیمر پارامترهای موثر بر فرایند مورد بررسی قرار گرفتند ت
ا فرایند در مناسبترین وضعیت ممکن راه اندازی شود.شکلهای ۳-۷ ،۳- ۸ و ۳-۹ تاثیر پارامترهای سن تلقیح ، سرعت هم زدن و دمای فرایند بیولوژیکی بر روی میزان مصرف قند، روند رشد سلولی و تولید بیوپلیمر را نشان می دهند.که در سن تلقیح ۲۴ ساعت وسرعت هم زدنrpm 250 ودمای فرایند بیولوژیکیc°۳۰ بیشترین میزان رشد سلولی وبیوپلیمر تولیدی را داشته ایم.
شکل ۳-۷- تاثیر سن تلقیح بر روی رشد سلولی تولید بیوپلیمردر شرایط فرایند بولوژیکی(T = 30°C، (shaking rate = 250 rpm
شکل ۳- ۸- تاثیر شدت هم زدن بر روی رشد سلولی وتولید بیوپلیمردر شرایط فرایند بیولوژیکی (T = 30°C،(seed age = 24
شکل ۳- ۹- تاثیر دما بر روی رشد سلولی تولید بیوپلیمردر شرایط فرایند بیولوژیکی(shaking rate = 250 rpm ،(seed age = 24
۳-۲-۱-۲- بررسی تاثیر نسبت میزان نیتروژن به کربن
از جمله عوامل تاثیر گذار بر افزایش محصول میزان نسبت منبع کربن به منبع نیتروژن در فرایندهای بیوژیکی تولید پلی هیدروکسی آلکانوآتها می باشد. نیتروژن بصورت ویژه باعث افزایش تولید بیوپلیمر در سلول می شود[۲۷].
تاثیرمیزان نسبت کربن به نیتروژن در تولید پلی هیدروکسی آلکانوآتها ، در فرایند های تک مرحله ای بارزتر می باشد. زیرا میزان تجمع استیل کوآنزیم A [۷۵] که عامل اصلی در سنتز پلی هیدروکسی آلکانوآتها می باشد به در صد نیتروژن موجود در محیط کشت بستگی دارد[۵۱] . اگر چه در تحقیقاتی سنتز بیوپلیمر توسط باکتریهای بومی از استیل کوآنزیم A در حضور منبع نیتروژن محدود شده است.
بر اساس تحقیقات انجام شده در موارد متعدد تاثیرمیزان نسبت کربن به نیتروژن در مقدار بین ۲۰ الی ۶۰ بوده است[۲۷-۲۹]. لذا در این تحقیق جهت بررسی تاثیرمیزان این نسبت در افزایش تولید پلی هیدروکسی آلکانوآتها، نسبتهای کربن به نیتروژن در چهار مقدار ۲۰ به ۱، ۳۰ به ۱، ۴۰ به۱ و ۵۰ به ۱ در طی فرایند بیولوژیکی توسط میکروارگانیسم C. necator بر روی گلوکز به عنوان منبع کربن مورد بررسی قرار گرفت.شکلهای ۳-۱۰، ۳-۱۱، ۳-۱۲ و۳-۱۳ تاثیر نسبتهای مختلف منبع کربن به منبع نیتروژن بر روی میزان تولید جرم بیولوژیکی ومیزان پلی هیدروکسی بوتیرات تولید شده را نشان می دهند.
درازای اعمال میزان نسبت کربن به نیتروژن ۱ به ۲۰ در محیط کشت میزان بیومس و پلی هیدروکسی بوتیرات تولید شده به ترتیب حدود ۸/۵ و ۹/۱ گرم بر لیتر بود. در حالیکه از میزان قند اولیه ۲۰ گرم بر لیتر میزان ۹ گرم بر لیتر مورد استفاده قرارگرفت(شکل ۳-۱۰) .
شکل ۳-۱۰- تاثیر نسبت نیتروژن به کربن (۱ به ۲۰) بر روی رشد سلولی وتولید بیوپلیمر
شکل ۳-۱۱- تاثیر نسبت نیتروژن به کربن (۱ به ۳۰) بر روی رشد سلولی وتولید بیوپلیمر
با افزایش میزان کربن نسبت به نیتروژن میزان بیومس و پلی هیروکسی بوتیرات تولید شده به ترتیب به مقدار حدود ۸ و۴/۲ گرم برلیتر رسید که درازای مصرف ۱۱ گرم بر لیتر از قند اولیه بوده است . بنابراین افزایش منبع کربنی نسبت به سوبسترا باعث افزایش تولید بیومس وهمچنین بیوپلیمر شده است. افزایش سنتز بیوپلیمر با افزوده شدن منبع کربن به محیط میتواند تاییدکننده این نظریه باشد که میکروارگانیسم جهت تولید بیوپلیمر به کربن اضافی در محیط نیازمند است [۲۱] .
شکل ۳- ۱۲- بیوپلیمر تولیدشده(PHB) ومیزان رشد سلولی به ازای مصرف گلوکز با نسبت کربن به نیتروژن ۴۰
در حالت دیگر استفاده از نسبت ۴۰ به ۱ برای منبع کربن و نیتروژن استفاده شد.که در تایید افزایش بیوپلیمر در ازای افزایش منبع کربن نسبت به منبع نیتروژن ، میزان بیومس وبیوپلیمر تولید شده افزایش قابل توجهی داشت شکل ۳-۱۲). این افزایش میزان بیوپلیمر تولید شده تایید تحقیقات گذشته نیز می باشد[۲۸] .در تحقیقی میزان تولید بیوپلیمر وهمچنین ترکیب کو پلیمر ها همراه با افزایش نسبت کربن به نیتروژن از ۲۰ به ۴۰ تاحدود ۷۲ در صد افزایش داشته است[۲۹] .در مطالعه ای دیگر ، برای تولید بیوپلیمر از فاضلاب صنعتی بیشترین مقدار مصرف COD[76] در نسبت کربن به نیتروژن ۴۰ به ۱بوده است. اما با افزایش میزان نسبت کربن به نیتروژن به ۵۰ به ۱ (شکل۳-۱۳)، شاهد کاهش میزان بیوپلیمر تولید شده بودیم که این امر می تواند به خاطر به خوردن حالت تعادل در نسبت کربن به نیتروژن و ایجاد فشار بر روی میکروارگانیسم باشد[۲۶] .
شکل ۳-۱۳- تاثیر نسبت نیتروژن به کربن (۱ به ۵۰) بر روی رشد سلولی وتولید بیوپلیمر
۳-۲-۲- استفاده از گلوکز بعنوان تنها منبع کربن
شکل ۳-۱۲ استفاده از گلوکز بعنوان تنها منبع کربن را نشان میدهد. استفاده از گلوکز، سبب تولید مونومر هیدروکسیبوتیرات گردید. پس از گذشت ۴۸ ساعت از کشت، میزان گلوکز موجود در محیط g/l 24 بود بنابر این میزان قند مصرفی حدود g/l 16 و بیوماس تولیدی حداکثر g/l 9 بود و حداکثر بیوپلیمر تولیدشده به g/l 3/3 رسید.
. دراین تحقیق میزان بازده بیومس به قند مصرفی ۶۴/۰ گرم بر گرم قند بود که در مقایسه با تحقیقی باستفاده از C. necator بر روی گلوکز، میزان بازده بیوس ۵/۰ گرم بر گرم قندمصرفی بوده است قابل توجه می باشد.در مطالعه ای دیگر با بهره گرفتن از میکروارگانیسم Alcaligenes eutrophus در محیط کشتی با غلظت g/l 20 گلوکز به تولیدی معادل g/l 97/0 بیوپلیمر دست یافتند که تمامی بیوپلیمر تولید هیدروکسیبوتیرات بود[۱۹]. در مطالعهای مشابه از گلوکز با غلظتی معادل g/l 30 استفاده شدو پلیمر تو
لیدی در این مطالعه نیز، هیدروکسیبوتیرات بود[۲۰].ضمنا بیشترین مقدار بیومس و همچنین پلی هیدروکسی بوتیرات تولید شده در حدود۴۰ ۱لی ۵۰ ساعت مطابق با سایر تحقیقات انجام شده تولید شده است[۱۰۲].
۳-۲-۳- استفاده ازفروکتوز بعنوان تنها منبع کربن
شکل ۳-۱۴ استفاده از فروکتوز بعنوان تنها منبع کربن را نشان میدهد. حداکثر وزن خشک سلولی معادل g/l 5/10 بود که از این میزان بیوماس تولیدی، g/l 9/5 پلیهیدروکسیبوتیرات حاصل گردید. تعیین میزان فروکتوز در محیط نشان داد که از g/l 40 فروکتوز اولیه در محیط کشت، میکروارگانیسم g/l 26 آنرا بمصرف رسانیده است. بموازات افزایش وزن خشک سلولی، تولید بیوپلیمر نیز افزایش یافته و پس از ۷۲ ساعت به حداکثر رسید. پس از این مدت شاهد افت ناگهانی تولید بودیم که دلیل این امر میتواند اسیدی شدن محیط باشد[۶۵] .میزان پلی هیدروکسی بوتیرات تولید شده توسط میکرو ارگانیسم C. necator بر روی فروکتوز بیشتر از سایر میکرو ارگانیسم های مورد بررسی در این تحقیق بوده است و با توجه به سایر مطالعات ، که با بهره گرفتن از فروکتوز به میزان ۴۰ گرم بر لیتر، بیوماسی معادل ۲۵/۳ و پلیهیدروکسیبوتیرات ۴/۱ گرم بر لیتر پس از گذشت ۴۸ ساعت بدست آوردند[۲۱] میزان قابل قبولی بوده است.
شکل ۳- ۱۴- بیوپلیمر تولیدشده(PHB) ومیزان رشد سلولی به ازای مصرف فروکتوز به عنوان سوبسترا
۳-۲-۴- استفاده از ملاس به عنوان منبع کربن
ملاس به عنوان منبع غنی قندی جهت تولید بیوپلیمر مورد استفاده قرار گرفته است.به علت غلظت بالای قندی ملاس (ساکارز،گلوکز وفروکتوز)،جهت دسترسی بهتر میکروارگانیسم ها به منابع قندی ،پس از رقیق سازی ۱ به ۳ ملاس به منظور کاهش ویسکوزیته،PH آن توسط محلول سود ۵/۰ نرمال از ۵ به حدود ۷ رسیدومحلول به مدت دریخچال نگهداری شد .در نهایت با اضافه نمودن منابع مغذی نظیر منبع نیتروژن و فسفر جهت استفاده در محیط کشت فرایند بیولوژیکی بکار رفت]۵۰[.
