۲-۳- دام مورد آزمایش و نحوه آماده سازی دام:
در این تحقیق از ۳ راس گوسفند نژاد قزل یکساله هم وزن (میانگین ۶/۲ ± ۴۹) که قبل از شروع آزمایش اخته شده بودند، استفاده گردید. ابتدا کلیه موارد بهداشتی متداول (اعم از واکسیناسیون، پشم چینی، سم چینی) در مورد دامها اعمال گردید، سپس طی عمل جراحی بر روی شکمبه گوسفندان آزمایشی، فیستولا نصب شد. بدین ترتیب که حیوان ۲۴ ساعت قبل از عمل جراحی تحت پرهیز غذا و آب قرار می گیرد و سپس در هنگام جراحی داروی آرامبخش زایلازین هیدروکلراید^۱ به حیوان تزریق می شود. ناحیه گودی کمری چپ ^۲پس از تراشیدن و ضد عفونی با تزریق داروی لیدوکائین هیدروکلراید ^۳در بافت پوست، ماهیچه و زیرپوست و دیواره شکمبه، این ناحیه بی حس می شود و سپس به کمک اسکالپل بر روی پوست برشی بطول ۱۲-۱۰ سانتی متر به موازات قوس دنده ها و در فاصله ۲ سانتی متری زائده عرضی مهره ها ایجاد می شود، عضلات مورب خارجی و داخلی، عضله عرضی و صفاق نیز در همین امتداد و به کمک قیچی بریده می شوند، پس از خارج کردن شکمبه، اطراف عضو به کمک تامپون های مرطوب پوشانده می شوند تا از ورود ترشحات شکمبه به درون حفره شکم جلوگیری شود، به کمک نخ کات گوت کرومیک^۴ نمره یک، بخیه سرکیسه ای به شکل بیضی با قطری متناسب با کانولا بر روی کیسه پشتی شکمبه کار گذاشته می شود. در این مرحله به کمک اسکالپل برشی طولی بر روی دیواره شکمبه و در مرکز بخیه سرکیسه ای ایجاد می شود و پس از وارد کردن کانولا، بخیه سرکیسه ای نیز محکم می شود و گره زده می شود، تا مخاط شکمبه کاملا به سمت داخل برگردانده شوند. سپس محل برش شکمبه را به کمک سرم فیزیولوژی استریل شستشو داده و شکمبه به محل اصلی خود بازگردانده می شود. عضلات دیواره شکم در دو لایه و به کمک نخ کات گوت کرومیک نمره یک و با الگوی ساده سرتاسری بخیه زده می شود. پوست به کمک نخ ابریشم نمره یک با الگوی زنجیری بخیه زده می شود و مهره مربوط به کانولا بسته می شود. پس از عمل جراحی، آنتی بیوتیک مناسب به مدت ۵ روز تجویز می شود. پانسمان زخم با افشانیدن ^۵آنتی بیوتیک به مدت ۲ هفته ضدعفونی می شود. بعد از عمل، حیوانات آزمایشی داخل محل های تعبیه شده در مزرعه تحقیقاتی دانشگاه آزاد اسلامی واحد مراغه نگهداری شدند. در این محل ها، آخور و آبشخور جداگانه تعبیه گردیده که متحرک و قابل شستشو بودند.
Nutral Detergent Fiber:NDF -1
Sodium Louryl Sulphate -2
Xylazine Hcl -1
Paralambar fossa -2
Lidocaine Hcl -3
Chromic catgut -4
Xylazine Hcl-1
Paralambar Fossa-2
Lidocaine Hcl-3
Chromic Catgut-4
Spray -5
۲-۴- جیره غذایی:
حیوانات مورد استفاده در این آزمایش در سطح کمی بیشتر از سطح نگهداری تغذیه می شدند. جیره غذایی این حیوانات با نسبتهای ۶۰ درصد علوفه یونجه و ۴۰ درصد خوراک مخلوط (کنسانتره) بود (ارسکوف^۱، ۱۹۷۹). غذای تعیین شده برای حیوانات به صورت منظم (روزی ۲ نوبت) در اختیار آنها قرار می گرفت تا سبب رشد و تراکم مناسب جمعیت میکروبی، در طول زمان تخمیر نمونه ها در شکمبه شود. همچنین در تغذیه این حیوانات، سنگ نمک به طور دائم، جهت تعادل تغذیه ای و نیز آب بطور آزاد در اختیار آنها قرار می گرفت.

۲-۵- آزمایش های هضمی:
۲-۵-۱- برآورد تجزیه پذیری به روش کیسه های نایلونی:
با این روش تجزیه پذیری چین های مختلف یونجه بوسیله کیسه های نایلونی از جنس داکرون (الیاف پلی استرمصنوعی^۲) که در شکمبه قرار می گرفتند، اندازه گیری می شد. کیسه ها دارای سوراخ هایی به قطر ۴۵ میکرومتر بوده به گونه ای که میکروارگانیسم ها می توانستند وارد آن شده و گاز حاصله از آن خارج می شد. ابعاد کیسه ها ۵×۱۰ سانتی متر بود، البته در نمونه های کمتر (از نظر مقدار) کیسه های کوچکتری می تواند مورد استفاده قرارگیرد. نمونه های یونجه توسط آسیاب چکشی با غربال ۲ میلیمتری آسیاب شدند. مقدار ۵ گرم از نمونه های یونجه در داخل کیسه ها قرار داده شد و درب کیسه ها بوسیله چسب مسدود گردید. زمان های انکوباسیون ۷۲،۴۸،۳۶،۲۴،۱۶،۱۲،۸،۴،۰ و ۹۶ ساعت بود. برای هر تیمار در هر ساعت ۶ تکرار تهیه شد، بطوری که درون شکمبه هر گوسفند ۲ کیسه قرار داده شد، بدین صورت که قبل از قرار دادن کیسه ها درون شکمبه حیوانات، کیسه ها در داخل کیسه ای از جنس پلی استر با قطر منافذ ۳ میلیمتر قرار داده شدند بطوریکه مایع شکمبه به راحتی می توانست وارد کیسه شود. و برای راحتی کار، کیسه بزرگ از چندین قسمت گره زده شد. سپس کیسه بزرگ که حاوی کیسه های نایلونی بود بوسیله نخ پلاستیکی گره زده شده و با بهره گرفتن از لوله لاستیکی به طول ۳۰ سانتی متر در داخل شکمبه شناور شدند. پس از اتمام زمان انکوباسیون، کیسه ها از طریق درب کانولا خارج شده سپس جهت شستشو در معرض جریان آب سرد قرار گرفتند تا زمانی که اعمال تخمیر متوقف شده آب خارج شده کاملا شفاف شود (البته در رابطه با زمان صفر، انکوباسیون صورت نگرفت)، زمان صفر تجزیه پذیری فقط با شستن نمونه ها در مجاورت آب اندازه گیری گردید (پتیت و ترمبلای^۱، ۱۹۹۲ ؛ تقی زاده و همکاران، ۲۰۰۵). در مرحله شستشو نبایستی ذرات چسبیده به قسمت خارجی وارد کیسه شده و همچنین محتویات داخل کیسه ها تحت فشار قرارنگیرد زیرا محتویات هضم نشده داخل کیسه ها از داخل روزنه های دیواره کیسه خارج می شوند. جهت تبخیر آب کیسه ها به مدت ۲۴ ساعت در درجه ۶۵ درجه سانتیگراد قرارگرفته و سپس به منظور تعیین درصد ماده خشک آن، مدت ۲۴ ساعت در دمای ۱۰۵ درجه سانتیگراد در داخل آون قرار داده شدند.
rskovØ-۱
Synthetic Polyester Fiber -2
درصد ماده خشک و پروتئین خام ناپدید شده از طریق فرمول های زیر محاسبه گردیدند.
فصل دوم:مواد و روشها
۱۰۰×(وزن کیسه – وزن کیسه همراه نمونه)/[(وزن کیسه – وزن کیسه همراه نمونه پس از انکوباسیون) – (وزن کیسه – وزن کیسه همراه نمونه)] = درصد ماده خشک ناپدید شده
۱۰۰ × (وزن اولیه خوراک×درصدپروتئین)/[(درصدپروتئین باقی مانده×وزن باقی مانده انکوباسیون) – (درصدپروتئین×وزن اولیه خوراک)] = درصد پروتئین ناپدید شده
Petit & Tremblay-1
Taghizadeh-2
توسط نرم افزار ناوی ^۱تجزیه پذیری بالقوه با بهره گرفتن از مدل P = a+b(1 – e^-ct) محاسبه گردید (ارسکوف و مکدونالد^۲، ۱۹۷۹؛ مکدونالد^۳، ۱۹۸۱ ؛ پتیت و ترمبلای^۴، ۱۹۹۲ ؛ تقی زاده و همکاران، ۱۳۸۲). در این فرمول ضرایب عبارتند از:
P = درصد تجزیه پذیری در زمان t ، t = زمان انکوباسیون، a = عرض از مبدا در زمان صفر و نشان دهنده مواد محلول، b = تجزیه پذیری مواد نامحلول، c = نرخ تجزیه پذیری بخش b در زمان t و e مبنای لگاریتم نپرین (۷۱۸۲/۲) می باشد.
اطلاعات حاصل از تجزیه پذیری در هر ساعت انکوباسیون توسط نرم افزار SAS و در قالب طرح کاملاً تصادفی با ۳ تیمار و ۶ تکرار مورد بررسی قرارگرفتند. مدل آماری طرح بصورت زیر بود.
Y_ij = µ+T_i+e_ij
Y_ij = مقدار هر مشاهده، µ = میانگین کل، T_i = اثر تیمار و e_ij = خطای آزمایشی می باشد.
۲-۵-۲ اندازه گیری تولید گاز در شرایط آزمایشگاهی:
برای اندازه گیری میزان تولیدگاز حاصل از تخمیر از روش فدوراک و هرودی^۵ (۱۹۸۳) استفاده شد. در این روش از میزان جابجایی آب لوله های آزمایشی مدرج متصل به شیشه های حاوی مایع شکمبه و نمونه خوراکی جهت اندازه گیری میزان گاز تولید شده استفاده می شود (ونگ و همکاران^۶، ۲۰۰۲؛ فدوراک و هرودی، ۱۹۸۳).
حدود ۳۰ میلی گرم از هر نمونه آسیاب شده (با غربال ۲ میلیمتری) در داخل شیشه های ۵۰ میلی لیتری استریل ریخته و برای هر نمونه ۳ تکرار در نظر گرفته شد. مایع شکمبه حدود ۲ ساعت بعد از خوراک وعده صبحگاهی از گوسفندان فیستوله دار که با جیره مخلوط ۶۰ درصد کنسانتره و ۴۰ درصد علوفه به مدت یک ماه تغذیه شده بودند (ونگ و همکاران، ۲۰۰۲)، جمع آوری و با پارچه ۴ لایه ای صاف و در فلاسک محتوی گاز کربنیک سریعا به آزمایشگاه منتقل گردید. مایع شکمبه و بافر تهیه شده طبق روش مک دوگال^۱ (۱۹۴۸) به نسبت یک قسمت از مایع شکمبه و دو قسمت از بافر به داخل ارلن ریخته شده و جهت جلوگیری از تخمیر هوازی و کاهش دمای مایع،گاز کربنیک به داخل مخلوط تزریق و در روی هیتر با دمای ۳۹ درجه سانتیگراد قرار داده شد.
Petit & Tremblay -4
Fedorak & Hrudey -5
Wang et.al -6
NAWAY -1
Ørskov & Mc Donald -2
Mc Donald-3
در هر شیشه حاوی نمونه مقدار ۲۰ میلی لیتر از مخلوط مایع شکمبه و مخلوط مکدوگال بر روی نمونه های خوراک ریخته شد و پس از تزریق گازکربنیک و بی هوازی نمودن محیط داخل شیشه در آن محکم بسته و در دستگاه انکوباتور شیکر در دمای ۳۹ درجه سانتی گراد با تعداد ۱۲۰ دور بر دقیقه قرار داده شد.
برای تصحیح گاز تولیدی با منشاء مایع شکمبه ۳ تکرار بدون نمونه خوراک (بلانک) و فقط با ۲۰ میلی لیتر از مخلوط مایع شکمبه و بافر در نظر گرفته و در انکوباتور قرار داده شد.
در زمان های ۲، ۴، ۶، ۸، ۱۲، ۱۶، ۲۴، ۳۶، ۴۸، ۷۲، و ۹۶ ساعت پس از قرار دادن شیشه ها در انکوباتور شیکردار، میزان گازتولیدی به روش فدوراک (جابجایی مایع) قرائت و ثبت گردید. حجم گاز تولیدی بر اساس وزن نمونه خوراک در هر زمان با بهره گرفتن از رابطه زیر تصحیح می شود.
V = (V_t – V_b) × ۱۰۰۰/W
که در این رابطه :
V: حجم گاز تولید شده بر حسب میلی لیتر به ازای هرگرم ماده خشک.
V_t: حجم گاز تولیدی در شیشه های حاوی نمونه خوراک بر حسب میلی لیتر.
V_b: حجم گاز تولیدی در شیشه های فاقد نمونه خوراک برحسب میلی لیتر.
وW: وزن نمونه خشک خوراک برحسب میلی گرم ماده خشک می باشد.
Mc Dougall-1
جهت تعیین مولفه های تولیدگاز از معادله مکدونالد(۱۹۸۱) استفاده شده است.
P = a+b(1 – e^-ct)
که در آن:
P: تولید گاز در زمان t