۳-۵-۱-۱۱-استخراج پلاسمید از کلنی‌های نوترکیب
پس از مشاهده باند ۱۵۰۰ نوکلئوتیدی در تصویر ژل‌آگارز ۱% پس از الکتروفورز، برای سویه از ویال‌های دارای پلاسمید حاوی توالی، از فریزر ºC70- خارج شد و lμ ۵۰۰ از آن‌ها درml 20 محیط LB مایع همراه با آمپی‌سیلین µg/ml100 تلقیح شده و تا رسیدن به OD حدود ۵-۵/۱ در شیکرانکوباتور ºC37 گرماگذاری شد. استخراج DNA با بهره گرفتن از کیت High pure plasmid isolation kit (Roche) طبق مراحل زیر انجام شد.

۱- انتقال ml 1 از کشت باکتری به یک ویال تمیز و سانتریفوژ برای ۳۰ ثانیه در rpm 8000
۲- حل کردن رسوب باکتری در µl 250 از بافر تعلیق^[۶۲] حاوی RNase که در یخچال نگه‌داری می شود
۳- افزودن µl 250 از بافر لیزکننده^[۶۳] به ویال و سروته کردن ویال به آهستگی
۴- انکوباسیون ویال به مدت ۵ دقیقه در دمای اتاق
۵- افزودن µl 350 از بافر اتصال^[۶۴] سرد به ویال و سروته کردن ویال به آهستگی. افزودن این بافر باعث تولید رسوب سفید رنگ می شود.
۶- انکوباسیون ویال به مدت ۵ دقیقه در یخ و سانتریفوژ به مدت ۱۰ دقیقه در rpm13000
۷- انتقال مایع رویی به تیوب فیلتردار^[۶۵] و سانتریفوژ به مدت ۶۰-۳۰ ثانیه در rpm13000
۸- دورریختن محلول زیری و افزودن lµ۵۰۰ از بافر شستشوی ۱^[۶۶] و سانتریفوژ با شرایط قبلی
۹- افزودن lµ ۷۰۰ از بافر شستشوی ۲ و دو بار سانتریفوژ با شرایط قبلی
۱۰- انتقال فیلتر به یک ویالml 5/1 تمیز
۱۱- افزودن lµ ۱۰۰-۵۰ از بافر انحلال^[۶۷] و سانتریفوژ با شرایط قبلی
۱۲- شستشوی مجدد فیلتر با همان بافر انحلال و سانتریفوژ مجدد
مایع زیری، پلاسمید استخراج شده می‌باشد. برای تایید فرایند استخراج و اطمینان از عدم شکستگی آن، lµ ۲ از محصول استخراج پلاسمید برای الکتروفورز با ژل‌آگارز ۸/۰% مورد استفاده قرار گرفت. در چاهک کناری نیز lµ۲ پلاسمید برش داده نشده برای مقایسه، بارگذاری شد.
۳-۵-۱-۱۲- توالی یابی پلاسمیدهای نوترکیب
پس از اطمینان از صحت انجام فرایند استخراج، lµ ۴۰ از هر یک از نمونه‌ها برای توالی‌خوانی با پرایمر عمومی^[۶۸] M13F به شرکت ماکروژن کره ارسال شدند.
۳-۵-۱-۱۳-بررسی نمونه‌های تعیین توالی شده
توالی­ها توسط نرم­افزارChromas pro بررسی شده و نهایتا میزان تشابه با باکتری­ های دیگر در پایگاه Eztaxone بررسی شد.
۳-۶-روش اندازه ­گیری آهن دوظرفیتی و آهن سه ظرفیتی
در این پژوهش برای اندازه ­گیری آهن کل و آهن دوظرفیتی از روش تیتراسیون استفاده شد، که در این روش ml 2 از محلول مورد آزمایش با دی­کرومات پتاسیم N1/0 تیتر شد، به این صورت که ml2 از محلول را به درون بشر ریخته شد، سپس بشر را بر روی همزن گذاشته و از بالا محلول دی­کرومات کم کم اضافه گردید، از روی حجم مصرفی دی کرومات می­توان میزان آهن دو ظرفیتی را اندازه گیری کرد، برای سنجش آهن کل با مقادیر بالای ۱% از روش تیتراسیون مانند آهن دو ظرفیتی استفاده گردید با این تفاوت که آهن کل یک مرحله احیاء توسط کلرید قلع دارد، به این صورت که ابتدا میزان آهن­های سه ظرفیتی موجود در محلول توسط کلرید قلع به آهن دو ظرفیتی احیاء شد، بعد از آن محلول حاصل را بر روی استیرر گذاشته و مانند سنجش میزان آهن دو ظرفیتی، دی کرومات به آن افزوده و از روی حجم مصرفی دی­کرومات میزان آهن کل اندازه ­گیری گردید (Penev Kalin, 2010).
۳-۷-تعیین pH مناسب برای اکسیداسیون آهن
اکسیداسیون آهن یا همان تبدیل آهن فروس به آهن فریک تحت تآثیر شرایط مختلف از جمله pH می­باشد، به این منظور در ارلن­های ۲۵۰ میلی لیتری از باکتری کشت داده شده در محیط کشت ۹K با درصد حجمی ۵% به محیط کشت­هایی با pH های، ۱، ۱٫۵، ۲، ۲٫۵و ۳ تلقیح گردید و در دمای C⁰34 با دور شیکر rpm150 قرار گرفت. هر دو روز یکبار به میزانml 4 از نمونه­ها برای اندازه گیری Fe⁺² و Fe total برداشته شد.
۳-۸-تعیین دمای بهینه برای اکسیداسیون آهن
به منظور بررسی دمای بهینه رشد باکتری میزان اکسیداسیون آهن، در سه دمایC⁰ ۲۸، C⁰32، ۳۷،C⁰40C⁰ بررسی شد. ارلن­های حاوی ml100محیط کشت، با درصد تلقیح ۵% باکتری، در شیکرانکوباتورهایی با دماهای بالا قرار داده شد، هر ۴ روز ml3 از ارلن­ها برای سنجش میزان آهن فریک و ml1 برای بررسی میزان رشد باکتری برداشته شد.
۳-۹-تعیین دانه بندی مناسب
دانه بندی یکی از پارامترهای مهم در فرایند فروشویی میکروبی می­باشد، به این دلیل که در دانه بندی­های بزرگتر از دانه بندی بهینه، سطح تماس باکتری به فلز کم شده و در دانه­بندی­های کوچکتر از دانه­بندی بهینه باکتری در اثر ضربات دانه­ها به دیواره از بین می­رود. از این رو در این پژوهش میزان اکسیداسیون آهن با پنج دانه بندی متفاوت بررسی گردید. ارلن­های ml250 حاوی ml100 محیط کشت که شامل ۵% باکتری و درصدجامد(پالپ) ۵% از نمونه با دانه بندی­های مختلف، mμ۴۵، mμ۷۵، mμ۱۰۶،mμ۱۲۶ وmμ۱۵۰، در شیکر انکوباتور با دمای C⁰40 و pH 5/1با دور شیکرrpm 150 قرار داده شد.
۳-۱۰-تأثیر میزان درصد پالپ
برای انجام این مرحله ارلن­های ml250حاوی ۱۰۰ml محیط کشت که درصد پالپ های مختلف ۲٫۵%، ۵%، ۷٫۵%،۱۰% و ۱۵% در شیکر انکوباتور با دمای C⁰40 و دور شیکر ۱۵۰rpm قرار داده شد و در فواصل زمانی ۴ روزه میزان آهن اکسید شده توسط دستگاه atomic absorbtion اندازه ­گیری گردید.
۳-۱۱-نگهداری سویه­ها در بانک میکروبی
اولین گزارش­های مربوط به نگهداری باکتری­ های شیمیولیتوتروف اکسیدکننده فلزات به حدود ۳۵ سال پیش بر می­گردد. و روش­ها و پروتوکل­های مربوط به نگهداری آنها روز به روز گسترش یافته است. روش­هایی مانند خشک کردن در انجماد، نگهداری از طریق گلوتامات مونو سدیم و بتائین گلی سین به کار رفته است. اما با بهره گرفتن از این روش­ها زمان نگهداری باکتری­ های دخیل در لیچینگ و یا تعداد آن­ها کم می­گردید و نگهداری آنها در زمان­های طولانی میسر نمی­گشت. بنابراین نگهداری باکتری­ ها در نیتروژن مایع به همراه گلیسرول و DMSO بهترین روش پیشنهاد شده برای نگهداری این دسته از باکتری­هاست (WU Xue-ling, 2013)، به همین دلیل از روش نگهداری در نیتروژن مایع برای نگهداری باکتری­ های جدا شده استفاده شد.
۳-۱۱-۱-نگهداری به روش نیتروژن مایع
بعد از کشت باکتری در محیط کشت اختصاصی ۹K استریل شده، از مایع نگهدارنده استفاده شد.
این مایع شامل: گلیسرول۱۰% + DMSO که گلیسرول را به مدت ۱۵ دقیقه اتوکلاو کرده و سایر مواد با فیلتر کردن به گلیسرول افزوده گردید.
سلول­های باکتری بعد از طی مرحله فاز نمایی و رشد کردن در دمای اتاق به مدت ۳۰ دقیقه قرار داده تا ذرات حاصل از اکسیداسیون آهن و سایر ذرات ته نشین شود. سپس محیط به مدت ۱۵ دقیقه با دور ۱۰۰۰۰ rpm در دمای C⁰4 سانتریفیوژ شد.
۳-۱۱-۲- نگهداری در نیتروژن مایع و بازیابی از نیتروژن مایع
در ابتدا،ویال­های باکتری در دمای ۴ درجه سانتی ­گراد به مدت ۳۰ تا ۴۰ دقیقه قرار داده شد. سپس ویال­ها به دمای ۲۰- درجه سانتی ­گراد به مدت ۱ ساعت و بعد از آن به دمای C⁰70- به مدت ۲ ساعت. و در نهایت در نیتروژن مایع فریز شدند.
۳-۱۲-رسم درخت فیلوژنی
آنالیز فیلوژنیک سویه منتخب با ترتیب بندی توالی سویه­ها با توالی­های مرتبط با آن جنس با بهره گرفتن از نرم افزار ClustalX انجام گرفت. درخت فیلوژنی پس از مرتب کردن توالی ژن ۱۶srDNA گونه­ های نزدیک به این جنس در نرم افزار ClustalX با بهره گرفتن از نرم افزار Mega version5 رسم شد. بررسی اعتبار شاخه­ های درخت با بهره گرفتن از نرم Bootstrap analysis صورت گرفت(محمدی­پناه،۱۳۸۶).
فصل چهارم
نتایج
نتایج
۴-۱-نمونه برداری
نمونه گیری به روش استاندارد انجام گردید، جدول (۴-۱) خصوصیات و ویژگی­های نمونه­های گرفته شده را نشان می­دهد. جدول ۴-۱) خصوصیات محل­های نمونه گیری