۴-بالن
۵-آب مقطر
۶- ویال
۳-۱-۳-۲- روش انجام کار
برای اسانس گیری ابتدا ۱۰۰ گرم گیاه توزین و درون بالن یک لیتری قرار گرفت. سپس بالن تا نیمه پر از آب شد و درون هیتر گذاشته شد و دستگاه کلونجر به آن وصل گردید.

درون دستگاه مقداری آب ریخته شد تا بعداً وقتی اسانس خارج گردید روی همین آب قرار ­گیرد. سپس شیر آب سرد نیز باز شد تا آب سرد به صورت مداوم جریان داشته باشد. هیتر روی دمای ۱۰۰ درجه سانتی ­گراد تنظیم شد تا آب درون بالن به جوش آید. از زمانی که آب به جوش آمد ۲ ساعت فرصت داد شد تا اسانس از گیاه خارج شد. سپس دستگاه خاموش و به حال خود گذاشته تا خنک شد. اسانس تولید شده در ظرف شیشه­ایی ریخته شد و پس از بسته شدن درب آن تا زمان استفاده در درون یخچال ۴+ درجه سانتی ­گراد قرار داده شد. جهت جدا کردن آب موجود در اسانس از سدیم سولفات انیدر استفاده شد.
این روش در مورد اسانس ­هایی به کار برده می­ شود که در اثر جوشانیدن با آب، آسیب ندیده و تخریب نشود. زمانی که آب به جوش می ­آید اسانس داخل گیاه به همراه آب بخار می­ شود و زمانی که به مبرد می­رسد چون آب سرد درون مبرد جریان دارد، هر دو به فاز مایع تبدیل می­شوند و به درون استوانه می­ریزند. آب پایین قرار می­گیرد و روی آن یک لایه روغنی اسانس قرار می­گیرد.
آب درون بالن هیچ­گاه خشک نمی­ شود. زیرا یک رابط وجود دارد که هر چه آب سر ریز می­ کند دوباره به درون بالن بر می­گردد. آبی که زیر اسانس قرار دارد درصد بسیار کمی از اسانس را در خود حل کرده است و عرق یا آب مقطر (Aromatic water) نام دارد. با خارج کردن این عرق اسانس خالص که روی آن قرار داشته بدست می ­آید. از هر ۱۰۰ گرم گیاه آویشن شیرازی حدوداً ۳ سی سی اسانس بدست آمد.
۳-۲- آزمون­های میکروبی
در این تحقیق اثر اسانس و عصاره آویشن شیرازی و نانو ذرات نقره به صورت جداگانه و ترکیبی بر روی ۵ سوش میکروبی بیماری­زا آزمایش گردید. برای تعیین اثرات ضد میکروبی از روش انتشار چاهکی استفاده شد. برای این کار ابتدا باکتری­ ها بر روی محیط مناسب کشت داده شد و سپس درون محیط کشت چاهک ایجاد گردید. غلظت­های مختلفی از هر کدام از نمونه­ها آماده شد و با حجم مشخص درون چاهک­ها قرار داده شد. سپس این مجموعه در انکوباتور با دمای مناسب (۳۵-۳۷ درجه سانتی ­گراد) قرار گرفتند و بعد از گذشت مدت زمان لازم برای رشد میکروارگانیسم (۲۴-۱۸ ساعت) آنها را بیرون آورده و مورد بررسی قرار گرفتند. لازم به توضیح است که به علت فرار بودن اسانس به محض آماده کردن اسانس و غلظت­های مختلف آن باید درون چاهک ریخته شود، در صورتی که در اطراف چاهک میکروارگانیسم‌ها کاملاً رشد کرده باشند اسانس، عصاره گیاه و نانو ذره نقره و ترکیب آن­ها اثر ضدمیکروبی ندارد و چنانچه در اطراف دیسک هاله عدم رشد مشاهده شد دارای اثر ضدمیکروبی می­باشد.
۳-۲-۱- باکتری­ های مورد مطالعه
باکتر­های گرم مثبت شامل:
استافیلوکوکوس اورئوس (ATCC25923)
استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی سیلین (ATCC33591)
استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس (ATCC14990)
استرپتوکوکوس پیوژنز (ATCC19615)
باکتری گرم منفی شامل:
سودوموناس آئروژینوزا (ATCC27853)
۳-۲-۲- مواد و وسایل مورد نیاز
۱- ترازوی آنالیتیکال جهت وزن کردن عصاره
۲- ترازوی دیجیتال جهت وزن کردن محیط کشت
۳- محیط کشت مولر هینتون آگار مرک آلمان
۴- محیط کشت مولر هینتون براث شرکت Q LAB
۵- اتوکلاو جهت استریل کردن محیط و وسایل
۶- انکوباتور جهت گرما گذاری
۷- سرم فیزیولوژی
۸- حلال DMSO 10٪
۹- آب مقطر استریل
۱۰- پودرکلرور باریوم جهت تهیه استاندارد ۵/۰ مک فارلند
۱۱- اسید سولفوریک ۹۸٪ جهت تهیه استاندارد ۵/۰ مک فارلند
۱۲- الکل ۷۰٪ و ساولن برای ضد عفونی کردن سطح کار
۱۳- پلیت یک بار مصرف استریل ۸ و ۱۰ سانتی­متری
۱۴- لوپ استریل
۱۵-سواب استریل
۱۶- لوله آزمایش
۱۷- بشر
۱۸- ارلن ۵۰۰ و ۱۰۰۰ سی سی
۱۹- پیپت مدرج
۲۰- میکروپلیت ۹۶ خانه­ایی
۲۱- استوانه مدرج
۲۲- پیپت پاستور
۲۴- سمپلر و سر سمپلر ۱۰۰ و ۱۰۰۰ میکرولیتر
۲۵- یخچال
۲۶- آون
۲۷- هود لامینار
۲۸- جا لوله­ایی
۲۹- ماژیک، خط کش و بر­چسب
۳-۲-۳- استریل کردن مواد و وسایل
کلیه وسایل باید به صورت استریل مورد استفاده قرار گیرند. جهت استریل کردن وسایل شیشه­ایی از آون (حرارت خشک) به مدت ۳ ساعت در دمای ۲۰۰ درجه سانتی ­گراد استفاده گردید. جهت استریل کردن محیط­های کشت و محلول­ها نیز از اتوکلاو (حرارت مرطوب) به مدت ۱۵ دقیقه در دمای ۱۲۱ درجه سانتی ­گراد و فشار ۱۵ پوند بر اینچ مربع استفاده گردید. برای استریل کردن لوله­های آزمایش درپیچ­دار و رک­های سمپلر، درب آن­ها را به حالت نیمه بسته قرار داده و سپس درون اتوکلاو قرار داده شد. کلیه کارهای میکروبی در کنار شعله و یا در زیر هود انجام گرفت. جهت استفاده از هود نیز ابتدا درون هود با الکل ۷۰ درصد کاملاً پاک شد و سپس درب هود بسته و لامپ اشعه ماوراء بنفش آن به مدت یک ساعت روشن گردید.
۳-۲-۴- محیط های کشت
۳-۲-۴-۱- محیط کشت مولر هینتون آگار^[۴۴]
از این محیط جهت بررسی اولیه اثرات ضد باکتریایی با تکنیک انتشار چاهکی استفاده می­ شود.
مواد متشکله این محیط عبارتند از:
Beef, dehydrated infusion from 300g
Casein hydrolysate 17.5g
Starch 1.5g