برخی محققان عامل کاهش میزان پروتئین را طی تنش خشکی، افت شدید فرایند فتوسنتز و متعاقب آن کاهش پیش­ماده­های تولیدکننده پروتئین و در نهایت کاهش سنتز پروتئین­ها بیان نمودند و رکود سنتز پروتئینها را به کاهش تعداد پلیزوم­های اتصالی به غشا نیز نسبت داده­اند. احتمالا کاهش mRNA، تخریب و یا غیر فعال شدن ریبوزوم­ها و کاهش سطح غشای سلولی سبب کاهش تعداد پلی زوم­ها می­ شود (Dhindsa and Clenland 1975).
از طرف دیگر، طی گزارشهای محققین، تنش آبی سطوح پروتئینی گیاهان را تحت تاثیر قرار داده و نتایج ضد و نقیضی را به همراه داشته است، به طوریکه برخی کاهش و گروهی افزایش در سطوح پروتئینی را تحت تنش آبی گزارش کرده اند (Pierre and Savoure 1990, Tod and Basler 1965, Close, 1996, Roy-Macaulay et al., 1992, Mrian et al., 2003 and Svensson et al., 2002). تنش خشکی بر پروتئین ذخیره دانه گیاه نخودفرنگی اثر معنی­دار داشته و با افزایش شدت خشکی، پروتئین محصول کاهش یافته­ است .(Mansourifar et al., 2011)
محمد خانی و حیدری در سال ۲۰۰۸ عامل کاهش میزان پروتئین­های محلول در گیاه ذرت تیمار شده با خشکی را افت شدید فرایند فتوسنتز و متعاقب آن کاهش پیش­ماده­های تولید کننده پروتئین و در نهایت کاهش سنتز پروتئین­ها بیان نمودند.
فلر گزارش کرد که تنش خشکی، بیان ژن­های کد کننده پروتئازهای درون سلولی را القا کرده و سبب تجزیه پروتئین­ها می­ شود. از این رو به­نظر می­رسد که کاهش محتوای پروتئین تحت تنش خشکی با کاهش سنتز و افزایش فعالیت آنزیم­ های تجزیه­کننده پروتئین مرتبط باشد (Feller, 2004).
۱-۱۴-۳ تاثیر تنش خشکی بر محتوای رنگیزه­های فتوسنتزی
کاهش رنگیزه­های فتوسنتزی، سازگاری ایجاد شده در گیاه تحت تنش است که احتمال آسیب به ماشین فتوسنتزی را با کم کردن تشکیل AOS کاهش می­دهد. شریعت و عصاره در سال ۱۳۸۵ کاهش میزان کلروفیل a و b و کاروتنوئید را در گیاه اکالیپتوس تحت تنش خشکی گزارش دادند. کاهش رنگیزه­های فتوسنتزی در گیاهان دیگر از جمله:
در ژنوتیپ­های مختلف گندم (Agnes, et al., 2009)، در سورگوم Neto, et al., 2009))، در ذرت (Efeoğlu, et al., 2009) و در لوبیا (Shardendu, et al., 2011) در شرایط تنش خشکی گزارش شده­است.
لازم به ذکر است که در برخی منابع بررسی شده، القا تنش خشکی با افزایش سطح رنگیزه­ها همراه بود، به­ طور نمونه Sungo و همکاران در سال ۲۰۰۴ افزایش مقدار کلروفیل در برگ­های جوان و افزایش بتاکاروتن در برگ­های بالغ آرابیدوپسیس وSchurr همکاران در سال ۲۰۰۰ افزایش کلروفیل را در Ricinus communis طی تنش خشکی گزارش کردند.
۱-۱۴-۴ بررسی اثر تنش خشکی بر محتوای MDA
پژوهش­ها نشان می­دهد که به­تدریج با شدت یافتن تنش خشکی، فعالیت آنزیم­ های آنتی­اکسیدانی گیاه تقلیل یافته و سطح MDA در سلول افزایش می­یابد. این امر به ذخیره H₂O₂ در سلول و افزایش پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی منتهی می­ شود. افزایش MDA با مکانیسم بازتاب منفی، مهار بیشتر فعالیت­های آنزیمی را موجب می­ شود. پراکسیداسیون لیپیدهای غشا موجب تخریب فراساختارهای فتوسنتزی و تنفسی شده و این موضوع به­عنوان یک عامل فیزیولوژیک در جهت کاهش محصولات کشاورزی در طی تنش خشکی به­حساب می آید (Bai li-Ping, et al., 2006).
افزایش محتوای MDA در Cowpea (Akhila, et al., 2008)، در ژنوتیپ­های مختلف گندم (Agnes, et al., 2009) و در سیاهدانه (کبیری و همکاران، ۱۳۹۲) نیز گزارش شده است.
۱-۱۴-۵ بررسی اثر تنش خشکی بر محتوای فنل تام
از آنجایی که ترکیبات فنلی، فعالیت آنتی­اکسیدانی قوی دارند و در دفاع علیه گونه­ های اکسیژن فعال در زمانی که فتوسنتز به علت تنش­های محیطی آسیب دیده است، شرکت می­ کنند (Naffati, 2010)، افزایش ترکیبات فنلی در طی دوره تنش خشکی دور از انتظار نیست و این در حالی است که تنش­های شدید خشکی ترکیبات فنلی را کاهش می­دهد که توجیح این حالت می ­تواند به این دلیل باشد که آب بر عملکرد فتوسنتز گیاه اثر به­سزایی دارد، پس طبیعی است که با کاهش فتوسنتز غلظت متابولیت­های ثانویه هم کاهش یابد(Cela, et al., 2009).
افزایش مقادیر فنل تام در برخی گیاهان توسط محققان گزارش شده است، از جمله:
در گیاه زیره cumin(Rebey, et al., 2011; Bettaieb, et al., 2011) ، در گیاه (Riadh, et al., 2007) Cakile maritime و همچنین در فلفل قرمز (Navarro, et al., 2006).
یافته­های فوق با نتایج تحقیقات کریسیتل ) (Chrisitelle در سال ۲۰۰۹ مغایرت دارد. کریسیتل به بررسی بیان ۱۳ ژن القاء خشکی در سیب زمینی پرداخت که در دو رقم کاهش بیان ژن مسیر بیوسنتز پلی­فنل و در نتیجه کاهش غلظت پلی­فنل مشاهده کرد. که این موضوع به نقش ساکارز به­عنوان فعال­کننده فاکتورهای رونویسی از ژن­های مسیر بیوسنتز پلی­فنل مرتبط می­ شود. غده­های سیب­زمینی در هنگام تنش خشکی با حفظ ذخایر نشاسته­ای خود باعث کاهش سطح ساکارز در غده­ها و در پی آن کاهش بیان ژن­های مسیر سنتز پلی­فنل­ها می­شوند. Neffati و همکاران در سال ۲۰۱۰ در گیاه گشنیز به نتایج مشابه با نتایج کریسیتل دست یافتند.
۱-۱۴-۶ بررسی اثر تنش خشکی بر محتوای پتاسیم برگ
تغذیه صحیح توتون پیش نیاز به دست آوردن محصول با کیفیت و کمیت بالا می­باشد. تامین محیط تغذیه ای مناسب، از جمله پتاسیم، یکی از مهم ترین فاکتورها در مدیریت محصول می باشد.
کوچنبوچ و همکاران (Kuchenbuch, et al. 1986) دریافتند که کاهش محتوای آب خاک، سبب کاهش جذب پتاسیم توسط ریشه های پیاز شد. ظریف کتابی و همکارن در سال ۱۳۷۹ گزارش کردند که تیمار خشکی بر چند گونه یونجه سبب کاهش تجمع پتاسیم در برگ شده است. دلیل این موضوع را کاهش جذب پتاسیم توسط ریشه اعلام نمودند. احتمالا علت کاهش پتاسیم در شرایط تنش خشکی، کاهش میزان حلالیت پتاسیم و متعاقبا کاهش جذب آن توسط ریشه های گیاه است.
گزارش­های دیگری مبنی بر افزایش نیاز گیاه به یون پتاسیم همراه با انباشته شدن آن در برگ گیاهان ناشی از دوره طولانی مدت خشکی وجود دارد که نشان­دهنده نقش این یون در تنظیم عملکرد روزنه­ها و افزایش فعالیت آنزیم­ های آنتی­اکسیدان در برگ­ها می­باشد (Cakmak, 2002 و صالحی اسکندری و همکاران ۱۳۹۰).
۱-۱۴-۷ نحوه عملکرد نانو مواد در تنش خشکی
با توجه به نقش عنصر پتاسیم در گیاه، وجود مقدار کافی این عنصر در شرایط تنش کم آبی در تنظیم سازگاری به این تنش موثر است. از سوی دیگر اخیرا کاربرد نانو کودها به عنوان راهکاری جهت کاهش مصرف مواد شیمیایی در سیستمهای زراعی مطرح شده است.
به دلیل اثرات مضری که کودهای شیمیایی در محیط زیست و کیفیت غذا ایجاد می­ کنند، مدتها است که استفاده از آن­ها مورد نکوهش قرار گرفته­است. در نانوکودها به­عنوان جایگزین کودهای مرسوم، عناصر غذایی کود به­تدریج و به صورت کنترل شده در خاک آزاد می­شوند و در نتیجه از بروز پدیده مردابی شدن آب­های ساکن و همچنین آلودگی آب آشامیدنی جلوگیری به­عمل خواهد آمد. در حقیقت با بهره­ گیری از فناوری نانو در طراحی و ساخت نانوکودها، فرصت­های جدیدی به­منظور افزایش کارایی مصرف عناصر غذایی و به حداقل رساندن هزینه­ های حفاظت از محیط زیست، پیش روی انسان گشوده شده است (Naderi and Abedi, 2012).
تبدیل مواد به مقیاس نانو، ویژگی­های فیزیکی، شیمیایی، بیولوژیکی و فعالیت­های کاتالیزوری آن­ها را تغییر می­دهد. علاوه بر انحلال­پذیری بیشتر، فعالیت­های شیمیایی و قابلیت نفوذ در غشای سلولی در این نانو ذرات پدیدار می­گردد (Mazaherinia, et al. 2010).
از آن­جا که درباره تاثیر نانو کلات پتاسیم بر تنش خشکی و همچنین درباره تاثیر نانو مواد بر تنش خشکی گیاه توتون منبعی در دسترس نبود، به ذکر تاثیر برخی نانو مواد در گیاهان مختلف پرداختیم.
معاونی و خیری (۲۰۱۱)، نشان دادند که تاثیر نانوذرات TiO₂ بر عملکرد ذرت قابل ملاحظه بود. در آزمایشی دیگر، ترکیبی از ذرات نانو SiO₂ و TiO₂ فعالیت نیترات رداکتاز را در سویا افزایش داد و توانایی جذب و استفاده از آب و کود را تشدید نمود ( Lu, et al., 2002). همچنین مظاهری­نیا و همکاران (Mazaherinia, et al., 2010) در آزمایشی گلخانه­ای دریافتند که کاربرد پودر اکسید آهن نانو نسبت به اکسید آهن معمولی، افزایش معنی­داری در غلظت آهن گیاه، طول سنبله، ارتفاع گیاه، وزن دانه در سنبله، کل وزن خشک کاه و کلش، وزن هزار دانه و وزن دانه در گندم داشته است. ممکن است این افزایش به دلیل خاصیت نانو ذرات و حلالیت بیشتر آن­ها و سبک و کوچک بودن آن­ها و شانس برخورد بیشتر ریشه­ها به ذرات نانو نسبت به ذرات اکسید آهن معمولی باشد. همچنین مشاهده شد که تیمار نانو نقره (۵۰ میلی­گرم بر لیتر) باعث افزایش درصد جوانه­زنی، طول ساقه­چه و ریشه­چه و در نهایت بهبود استقرار گندم گردید (Salehi and Tamaskoni, 2008).
نظران و همکاران در سال ۱۳۸۸ در بررسی نانو کلات آهن بر خصوصیات کیفی و کمی گندم دیم به این نتیجه رسیدند که محلول­پاشی نانو کلات آهن سبب افزایش صفات مذکور نسبت به شاهد شده است.
۱-۱۵ اهداف پژوهش
یکی از معضلات اصلی کشت توتون در ایران بالا بودن نیاز آبی این گیاه در طول دوره رشد است. تعیین تحمل نسبی به خشکی در توتون از اهمیت ویژه­ای برخوردار است، لذا با ارائه راه­کارهای مناسب جهت افزایش مقاومت این گیاه به خشکی، با اطمینان بیشتری می­توان آن را در مناطق خشک و نیمه خشک کاشت و از آن­جا که بیشترین مناطق کشت توتون در ایران دچار معضل خشکی هستند، یافتن راه حل مناسب برای افزایش مقاومت توتون به خشکی ضروریست.

علاوه بر بعد تجاری و صنعتی استفاده از توتون در دنیا، امروزه این گیاه به­عنوان پدیده جدیدی در صنعت گیاهان دارویی به دنیا معرفی شده است. توالی­یابی ژنی و دستکاری بیان ژن­های مختلف در این گیاه جهت افزایش تحمل آن به خشکی و مقابله با پاتوژن­ها و یا استفاده از نیکوتین برای درمان برخی بیماری­ها مثل پارکینسون به خوبی گویای اهمیت دارویی توتون در دنیا می­باشد.
در این راستا با وجود اهمیت اقتصادی و دارویی گیاه توتون و با توجه به اهمیت تکنولوژی نانو طی دهه گذشته، هدف از این تحقیق بررسی میزان مقرون به صرفه بودن استفاده از این کودها نسبت به کودهای معمولی از نظر مقدار کود مورد استفاده است، که در نانو کودها این مقادیر بسیار کمتر از کودهای معمولی است و به دنبال آن کاهش آلودگی محیط زیست به دلیل آزادسازی تدریجی و کنترل شده کودهای نانو در خاک و جلوگیری از پدیده مردابی شدن می­باشد و همچنین از آن­جا که پتاسیم نقش به­سزایی در فعالیت­های حیاتی گیاه دارد با تامین این عنصر در گیاه از اثرات مخرب ناشی از تنش خشکی نیز جلوگیری می­ شود.
فصل دوم
مواد و روش­ها
۲-۱- تجهیزات و مواد شیمیایی
۲-۱-۱ مواد شیمیایی
ترکیبات شیمیایی مورد استفاده در انجام این پژوهش شامل: نانو کلات پتاسیم خریداری شده از شرکت خضراء، پلی اتیلن گلایکول ۶۰۰۰ مارک Dae Jung ساخت کشور کره، استون، متانول، معرف Folin-Ciocalteu، گالیک اسید، آلبومین سرم گاوی، کربنات سدیم، آب دیونیزه، پتاسیم استات، نین هیدرین، اسید استیک گلاسیال، اسید فسفریک، اسید سولفوسالسیلیک، اسید فسفریک، تولوئن، پرولین، تری کلرو استیک اسید و ازت مایع می باشد.
۲-۱-۲ تجهیزات
۱- اسپکتروفتومتر مدلCamSpec M501 Single Beam UV/Visible
۲- انکوباتور شیکردار از شرکت Labcon
۳- سانتریفیوژ مدل Sigma 1-14
۴-سانتریفیوژ یخچال‌دار مدل Sigma 2KD
۵- ترازوی دیجیتال با دقت (٠٠١/٠) AND-GF300
۶- pH متر مدل Eutech instruments pH510
۷- ورتکس
۸- هیتر- استیررHP-3000
۹- حمام آب گرم (بن ماری)
۱۰- سمپلر ١٠٠٠ و ١٠٠ میکرو لیترBIOHIT