پروتئین های مرتبط با بیماریزایی یا PRPs، پروتئین­هایی هستند که توسط گیاه در مقابل عامل بیماریزا تولید گردیده و در فعال شدن سیستم دفاعی گیاه فعال نقش تعیین کننده ­ای دارند و می­توانند توسعه و گسترش پاتوژن در داخل گیاه را محدود کنند (Liu and Ekramoddoullah, 2006; Datta and Muthukrishnan, 1999). در بین این پروتئین­ها می­توان به پراکسیدازها (خانواده PR-9) اشاره کرد. در مطالعه­ایکه توسط هندسون و هوول (Hanson and Howell, 2004) نشان داده شد که جدایه­های T. viride موثر در بیوکنترل قارچ R. solani ترکیبات مرتبط با دفاع از جمله فیتوالکسین­ها (ترپنوئیدها) و آنزیم پراکسیداز در گیاه پنبه تولید می­ کنند. در این بررسی الیسیتورهای پروتئینی با وزن مولکولی ۱۸ کیلو دالتون را از ترشحات خارج سلولی تریکودرما جداسازی و شناسایی کردند که باعث القاء مقاومت در گیاه شد. (۲۰۰۵) پروتئین sm1 به­عنوان الیسیتوری از T. virens شناسایی و معرفی گردیده که در القای بیان ژن­های مرتبط با دفاع به­ صورت موضعی و سیستمیک در گیاه پنبه نقش دارد (Djonovic and Kenerly, 2005). تنگ و همکاران ۲۰۰۸) (Tseng et al., پروتئین­های ترشح شده از قارچ T. harzianum را در مدل شبیه سازی شده، از تداخل گیاه - تریکودرما - رایزوکتونیا بدست آوردند. این ترکیبات شامل آنزیم­ های کیتیناز، سلولاز، زایلناز، بتا ۱و۳ گلوکاناز، بتا ۱و ۶ گلوکاناز، ماناز و پروتئاز بودند.
۲-۲-۹-۴- ۱-۳ - القای مقاومت از طریق فعال کردن آنزیم پراکسیداز
پراکسیدازها اثر مستقیم در مقاومت داشته و از طریق تولید رادیکال آزاد و پراکسیدهیدروژن، که برای بعضی بیمارگرها سمی هستند، منجر به دفاع در برابر بیمارگرها می­شوند. دخالت آنزیم پراکسیداز در واکنش­های دفاعی و اثر بازدارندگی آن از رشد عوامل بیماری­زا اولین بار در سال­های ۶۹-۱۹۶۸ اثبات گردید (Liu and Ekramoddoullah, 2006; Peng and Kuc, 1992; Yedidia et al., 1999). تحقیقات نشان داده است که اکسیداسیون ترکیبات فنلی از قبیل Catechin به­وسیله آنزیم پراکسیداز ممکن است فاکتور محدود کننده رشد عوامل بیماری­زای باکتریایی در گیاهان پنبه مقاوم به بلایت باکتریایی باشد (Vidhyasekaran, 2002).

هوول و پوخبار (Howell and Puckhabar, 2005) در تحقیقی نشان دادند که استرینی از T. virens به­عنوان عامل بیوکنترل موثر در کنترل بیماری مرگ گیاهچه پنبه، باعث القاء فیتوالکسین­های ترپنوئیدی در ریشه گیاه پنبه شده است. به­عبارت دیگر این استرین پروتئین­های الیسیتوری را تولید می­ کند که منجر به القاء فعالیت آنزیم پراکسیداز و تولید ترپنوئید می­ شود. تحقیقات بر روی مکانیسم­های بیوکنترلی قارچ T. virens در جلوگیری از بیماری مرگ گیاهچه با عامل R. solani نشان داد که مایکوپارازیتیسم و تولید آنتی­بیوتیک در این کنترل مهم نمی ­باشد. در این بررسی تیمار بذر پنبه با قارچ T. virens باعث القاء آنزیم پراکسیداز و ترکیبات ترپنوئیدی (دزکسی همی گوسیپول و همی گوسیپول) می­شده که از پیشروی قارچ بیماریزای R. solani جلوگیری می­ کنند.
آزاد دیسفانی و همکاران (۱۳۹۲) تغییرات فعالیت آنزیم پراکسیداز در ریشه­چه پنبه را تحت تیمارهای قارچ رایزوکتونیا به تنهایی، قارچ تریکودرما به تنهایی، و مخلوط هر دو قارچ بررسی نمودند. ارزیابی فعالیت پراکسیداز نشان داد که این آنزیم در تمامی تیمارها نسبت به تیمار شاهد (بدون هر دو قارچ) افزایش یافته، اما میزان فعالیت این آنزیم از نظر آماری در تیمار هر دو قارچ (عامل بیولوژیک و عامل بیماریزا) به­ صورت توام از میزان بالاتر و پایدارتری برخوردار بوده و در نتیجه باعث القای مقاومت در گیاهچه پنبه می­ شود.
نتایج تحقیقات دیگران نیز نشان داده است به دنبال مایه­کوبی بیمارگر در گیاهان میزبان، فعالیت پراکسیداز افزایش می یابد (Scott-Craig et al., 1995) و افزایش فعالیت این آنزیم نیز با مقاومت گیاهان در برابر بیماری در ارتباط می باشد (Hammerschmidt et al., 1982). Veech (1976) نیز گزارش کرده است که با نفوذ قارچ رایزوکتونیا به گیاه پنبه موادی ترشح می­ شود که منجر به افزایش فعالیت پراکسیداز می­ شود. Howell و همکاران (۲۰۰۰) نیز طی تحقیقاتی بیان داشتند که القاء مقاومت در گیاهچه­های پنبه توسط T. virens علیه بیماری مرگ گیاهچه (R. solani)، در اثر افزایش فعالیت پراکسیداز و سنتز ترپنوئیدها در ریشه و در مواجه با عامل بیماریزا می باشد. مرتضی نیا و همکاران (۱۳۸۹) نیز در تحقیقاتی نشان دادند که القاء مقاومت در گیاهچه­های خیار تیمار شده با T. harzianum Bi ، قبل و بعد از مایه زنی با Pythium aphanidermatum در ارتباط با حداکثر فعالیت آنزیم پراکسیداز است.
۲-۲-۹-۴- ۱-۴- القای مقاومت از طریق فعال کردن آنزیم بتا- ۱و۳ گلوکاناز و تولید فنل
از جمله ترکیبات دیگری که در واکنش دفاعی گیاه در مقابل بیمارگرها دخیل بوده و دارای اهمیت می­باشند، ترکیبات فنلی هستند که اولین بار در سال ۱۹۲۹ فرضیه سنتز ترکیبات فنلی برای توجیه مقاومت گیاهان در برابر بیماری­ها پیشنهاد گردید. سپس محققان مختلف تغییر ترکیبات فنلی و نقش آن­ها در ایجاد مقاومت در گیاهان بیمار را مورد مطالعه قرار داده که نتایج آن­ها حاکی از تجمع مواد فنلی در ارتباط با واکنش مقاومت است. برخی از ترکیبات فنلی مثل اسید کلروژنیک و اسید کافئیک در تعداد زیادی از انواع گیاهان وجود داشته که در واکنش های دفاعی گیاه در برابر عوامل آسیب رسان دخالت می­ کنند. در ارتباط میزبان و عامل بیماری­زا و مقایسه ارقام مقاوم و حساس، در بیشتر موارد سرعت تجمع ترکیبات فنلی بعد از ابتلا به بیماری در رقم مقاوم زیادتر از رقم حساس است و یک رابطه خطی مثبت بین مقدار ترکیبات فنلی و مقامت گیاه وجود دارد (Goodman et al., 1986).
همچنین مشخص گردید که آنزیم بتا ۱و۳ گلوکاناز نیز در القای مقاومت توسط تریکودرما در گیاهان نقش دارد.
آزاد دیسفانی و همکاران (۱۳۹۲) تغییرات فعالیت آنزیم بتا-۱و۳ گلوکاناز و میزان فنل کل عصاره ریشه­چه پنبه را با بهره گرفتن از روش­های کالریمتری و دستگاه اسپکتروفتومتر بررسی نموده و نشان دادند که حداکثر میزان این ترکیبات در عصاره ریشه­چه گیاهان تیمار شده با جدایه­های تریکودرما به همراه قارچ رایزوکتونیا وجود دارد. ارزیابی فعالیت آنزیم بتا-۱و۳ گلوکاناز نیز نشان داد که قارچ تریکودرما و رایزوکتونیا هر کدام به تنهایی باعث افزایش فعالیت این آنزیم و در نتیجه القاء مقاومت در گیاهچه پنبه می­شوند. اما تیمار تریکودرما به­همراه قارچ عامل بیماری نسبت به تیمار جدایه تریکودرما به تنهایی، تیمار عامل بیماری به تنهایی و نیز شاهد سالم، موجب افزایش بیشتر فعالیت آنزیم بتا ۱و۳ گلوکانازمی­شود.
مطابق با نظرات Heil and Ploss (2006) آنزیم بتا-۱ و ۳ گلوکاناز پس از زخمی شدن گیاه و یا آلودگی بیولوژیک، تشکیل و فعالیت­های آن القاء می­ شود. طی تحقیقاتی دیگری نشان داده شد که فعالیت پراکسیدازها، بتا-۱و۳ گلوکانازها و کیتیازها در اثر استفاده از یک نوع رایزوکتونیای دو هسته­ای در گیاهچه­های لوبیا افزایش یافته و این افزایش ارتباط نزدیکی با افزایش مقاومت به پوسیدگی ریشه ناشی از R. solani داشت (Xue et al., 1988).
فصل سوم
مواد و روش ها
۳-۱- مواد مورد نیاز
موادآزمایشی شامل قارچ عامل بیماری Verticilium dahliae ، گلخانه، گلدان، بذر پنبه، کیسه­های پلاستیکی نمونه برداری، قیچی، لوله­های آزمایش، ظروف پتری، محیط های کشت، مواد شیمیائی، اتوکلاو، هود استریل، میکروسکوپ و انکوباتور بوده که مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی مازندران تامین گردید.
۳-۲- روش تحقیق
۳-۲-۱- تهیه محیط های کشت مورد استفاده جهت جداسازی و رشد جدایه ها
۳-۲-۱-۱- محیط کشت آب آگار ^[۱۸](WA)
برای تهیه این محیط مقدار ۲۰ گرم پودر آگار را در ۱ لیتر آب مقطر حل کرده و محیط حاصل به مدت ۱۵ دقیقه در حرارت ۱۲۱ درجه سانتی گراد در اتوکلاو سترون گردید. از این محیط کشت برای تک ریسه کردن و خالص سازی جدایه های قارچ و همچنین نگهداری جدایه های خالص شده در لوله های آزمایشگاهی در محیط ۴ درجه سانتی گراد استفاده شد.
۳-۲-۱-۲- محیط کشت سیب زمینی، دگستروز آگار^[۱۹](PDA)
از این محیط کشت جهت جداسازی، تعیین رنگ کلونی، میزان رشد پرگنه و بررسی ویژگی­های خصوصیات ظاهری جدایه های قارچ استفاده شد. برای این منظور از محیط کشت PDA به میزان ۳۹ گرم پودر آماده آنرا به یک لیتر آب مقطراضافه و محیط حاصل را حرارت داده تا کاملا حل گردد. سپس محیط فوق در دمای ۱۲۱ درجه سانتی گراد به مدت ۱۵ دقیقه در اتوکلاو سترون گردید.
۳-۳- نمونه برداری بوته های آلوده به قارچ Verticillum daheliae
به منظور جمع آوری بوته­ های آلوده پنبه در تیر ماه سال ۱۳۹۲ مزارع مختلف پنبه واقع در شهرستان گنبد کاووس مورد بازدید قرار گرفت. بوته­ های پنبه آلوده و مشکوک از ۵ مزرعه جمع آوری و به آزمایشگاه انتقال داده شد. نمونه ها تا زمان بررسی در دمای ۴درجه سانتی گراد نگهداری شدند.
۳-۴- جداسازی قارچ عامل بیماری
جهت جداسازی قارچ نمونه­های انتقال داده شده به آزمایشگاه، ابتدا با آب شستشو شدند. سپس بخش­هائی از طوقه و ریشه آلوده انتخاب و به قطعاتی به ابعاد ۱ × ۱ سانتی­متر جدا و با هیپوکلریت سدیم ۱۰ درصد تجارتی به مدت ۳۰-۶۰ ثانیه ضدعفونی سطحی شدند. قطعات ضدعفونی شده پس از ۳ بار شستشو با آب مقطر استریل، هر بار به مدت ۳ تا ۴ دقیقه و خشک کردن با کاغذ صافی استریل، در پتری­های حاوی محیط کشت PDA کشت و در دمای ۲۵ درجه سانتی گراد در شرایط تاریکی نگهداری شدند (Kim et al., 2001).
خالص سازی قارچ به­روش تک اسپور روی محیط کشت آب آگار انجام گرفت (Jones and Clifford, 1983).
۳-۵- آزمون بیماریزائی جدایه­ها
آزمون بیماریزائی جدایه­ها روی پنبه رقم ساحل (حساس به بیماری) تعیین و جدایه­های با قدرت بیماریزائی بیش­تر به­عنوان جدایه­های برتر برای آزمون­های بعدی انتخاب شدند. در این رابطه تعداد ۱۰۰عدد بذر پنبه پس از ضد عفونی سطحی با هیپوکلریت سدیم، جوانه دار شده و جهت مایه زنی به مدت ۲ ساعت به در سوسپانسیون اسپور قارچ V. daheliae با غلظت مناسب (۱۰^۶×۱ اسپوردر هر میلی­لیتر) قرار گرفتند. بعد از حذف سوسپانسیون اضافی، بذور تلقیح شده در پتری دیش حاوی ۳ برگ کاغذ صافی استریل مرطوب قرار گرفتند. در این آزمایش در تیمار شاهد به جای سوسپانسیون اسپور، از آب مقطر استریل استفاده گردید. پتری دیش حاوی بذور تلقیح شده در کیسه­های پلاستیکی نگهداری شدند. بعد از ظهور علائم بیماری روی گیاهچه­ها، درصد آلودگی^[۲۰] با بهره گرفتن از فرمول ذیل تعیین شد (Schteinberg, 1997) :
DI=[(a-b)/a×۱۰۰]
DI= درصد آلودگی
a= تعداد کل بوته ها
b= تعداد بوته های سالم
۳-۶- جداسازی و شناسایی قارچ تریکودرما
جهت جداسازی قارچ تریکودرما، به صورت تصادفی و از اطراف ریشه بوته­ های پنبه تا عمق ۳۰ سانتی متری نمونه برداری شد (ظفری و همکاران، ۱۳۸۱). نمونه برداری از پنج نقطه مختلف از هر مزرعه انجام گرفته و در نهایت خاک­های هر مزرعه با هم مخلوط شدند. نمونه خاک­های هر مزرعه پس از انتقال به آزمایشگاه مرطوب گشته و به مدت یک هفته درون کیسه­های پلاستیکی و در حرارت اتاق نگهداری شده تا قارچ­های احتمالی موجود در آن ها فعال شوند.
سپس عمل رقیق سازی براساس روش وین­فوندرا و همکاران (Wigenfundera et al., 1991) انجام گرفت. برای این منظور ، ۱۰ گرم از خاک هر مزرعه به ۹۰ میلی لیتر آب مقطر سترون شده، اضافه گردید و به مدت ۳۰ دقیقه روی دستگاه همزن قرار داده شد تا سوسپانسیون تقریبا یکنواختی بدست آمد. به این ترتیب رقت ^۱-۱۰ از سوسپانسیون فوق به دست آمد. بعد ۱۰ میلی­لیتر از این سوسپانسیونرا برداشته و به ۹۰ میلی لیتر آب مقطر سترون دیگر اضافه و مجددا حدود ۱۵ دقیقه روی دستگاه همزن قرار داده شد. به این ترتیب، رقت ^۲- ۱۰ به­دست آمد. با ادامه این روش رقت­های ^۳- ۱۰ و ^۴- ۱۰از این محلول تهیه گردید. سپس یک میلی لیتر از هر رقت در پتری­های حاوی محیط کشت اختصاصی مکفادن و ساتون (RB-S-F) پخش شد (Davet and Rouxel, 2000)
KH₂PO₄ ۲۵/۰ گرم
سولفات منیزیوم ۱۲۵/۰گرم
پپتون ۲۵/۱ گرم
گلوکز ۵/۲ گرم
رز بنگال ۰۰۴/۰ گرم
سولفات استرپتومایسین ۰۰۷۵/۰ گرم
آگار ۵ گرم
فرمالدویید ۵۰ میکرولیتر
آب مقطر استریل ۲۵۰ میلی لیتر
ترکیبات فوق (غیر از فرمالدهید و سولفات استرپتومایسین) در دمای ۱۲۱ درجه سانتی ­گراد و فشار ۲/۱ اتمسفر به­مدت ۱۵ دقیقه استریل شدند. پس از سرد شدن (حدود ۴۰ درجه سانتی ­گراد) و قبل از تقسیم محیط کشت به ظروف پتری، فرمالدهید و سولفات استرپتومایسین به آن اضافه شدند. سپس محیط کشت فوق به ظروف پتری ۹ سانتی­متری انتقال داده شد. پس از سرد شدن، از هر رقت سوسپانسیون خاک، به میزان ۱ میلی­­لیتر روی محیط کشت هر ظرف پتری پخش گردید. برای هر رقت خاک سه تکرار در نظر گرفته شد. ظروف پتری به مدت ۹۶ ساعت در دمای ۲۵ درجه سانتی گراد و در تاریکی نگهداری شده تا رشد میسلیوم­ها به خوبی انجام گیرد. بعد پتری­ها از انکوباتور خارج و در شرایط آزمایشگاه نگهداری شده تا کنیدی­های قارچ تریکودرما تشکیل شوند(Davet and Rouxel, 2000).
جدایه­های به دست آمده از هر یک از نمونه­های خاک، به ظروف پتری حاوی محیط کشت آب مقطر منتقل شدند. با گرفتن تک اسپور و انتقال به محیط کشت PDA عمل خالص خالص سازی انجام گرفت.
از نمونه­های خاک به دست آمده، تعداد ۵ جدایه تریکودرما جداسازی گردید. برای شناسایی تریکودرما از کلید معتبر کلید معتبر کوبیسک و هارمن (Kubicek and Harman, 1998) استفاده گردید.
برای مطالعه میزان رشد جدایه­ها و همچنین بررسی مشخصات ماکروسکپی و میکروسکوپی آن­ها، یک اسپور جوانه زده از هر جدایه در مرکز پتری حاوی محیط کشت مالت آگار ۲% قرار داده شده و در دمای ۱± ۲۰ درجه سانتی گراد و در شرایط تاریکی برای ۲ روز نگهداری و سپس در فضای آزمایشگاه، در شرایط تناوب نوری در همین دما قرار گرفتند. میزان رشد در روز­های چهارم و هفتم در دو جهت عمود برهم اندازه گیری و میانگین قطر پرگنه برای هر جدایه محاسبه گردید.
مشخصات ماکروسکپی پرگنه­ها شامل رنگ کلنی، خوابیده یا کرکی بودن، نحوه کنیدیوم زایی (به صورت جوش و دسته ای یا به صورت پراکنده) با کشت جدایه­ها روی محیط مالت آگار بررسی شد. همچنین در بررسی میکروسکپی، اندازه گیری طول و عرض کنیدی و فیالیدها و همچنیندیدن وضعیت وشکل کنیدیوفور، کنیدی و کلامیدوسپورها، اسلایدهایی با قرار دادن نمونه داخل یک قطره اسید لاکتیک ۲۵% روی لام تهیه و در زیر میکروسکوپ نوری مشاهده گردید.
۳-۷- بررسی تاثیر جدایه­های تریکودرما روی قارچ عامل بیماری
برای این منظور در هر تشتک پتری ۹ سانتی متری حاوی محیط کشت PDA، بلوکی به قطر ۵ میلی­متر از کشت پنج روزه قارچ V. daheliae به فاصله یک سانتی­متر از لبه پتری قرار داده شد. پس از ۴ روز یک بلوک از قارچ آنتاگونیست به قطر ۵ میلی­متر از کشت پنج روزه هر کدام از جدایه­های تریکودرما در طرف مقابل کشت قارچ عامل بیماری در پتری قرار داده شد. این آزمایش در قالب طرح کاملا تصادفی با سه تکرار انجام شد. پتری­های آزمایشی در انکوباتور در دمای ۲±۲۵ درجه سانتی ­گراد نگهداری شدند. پس از ۳ تا ۴ روز قطر کلنی در دو جهت عمود برهم اندازه گیری و میانگین قطر پرگنه برای هر جدایه محاسبه گردید. اندازه گیری و درصد بازدارندگی از رشد عامل بیماری با بهره گرفتن از فرمول ذیل محاسبه گردید (Pandyet al., 1982).
%GI = (dc- dt / dc) × ۱۰۰
GI بازدارندگی از رشد (میلی­متر)
Dc میانگین قطر رشد قارچ در تیمار شاهد (میلی­متر)
Dt میانگین قطر رشد قارچ در تیمار مورد بررسی (میلی­متر)
۳-۸- بررسی تاثیر ترکیبات گازی فرار کشت ۹۶ ساعته آنتاگونیست­ها روی رشد میسلیومی قارچ ورتیسلیوم
در این رابطه ابتدا یک حلقه پنج میلی­متری از کشت پنج روزه هریک از آنتاگونیست­ها به­تفکیک در وسط ظرف پتری حاوی محیط کشت PDA قرار داده شد. پس از ۹۶ ساعت رشد آنتاگونیست­ها درانکوباتور در دمای ۱±۲۵ درجه سانتی ­گراد، یک حلقه پنج روزه ورتیسلیوم در وسط ظرف پتری محتوی PDA قرار داده شد. سپس با احتیاط درشرایط استریل درب پتری­های حاوی آنتاگونیست­ها و ورتیسلیوم برداشته و پتری محتوی ورتیسلیوم به طور وارونه روی ظرف پتری محتوی قارچ­های آنتاگونیست قرارداده شد. آنگاه لبه پتری­ها با پارافیلم به دقت مسدود ­گردید. درتیمار شاهد، پتری محتوی ورتیسلیوم روی پتری PDA بدون آنتاگونیست، قرار گرفت. این آزمایش در قالب طرح کاملا تصادفی با سه تکرار انجام گرفت. شعاع رشد پرگنه ورتیسلیوم پس از تکمیل رشد قارچ در پتری شاهد اندازه گیری گردید Kucuk and Kivanc, 2003) ).