۱۰- با محلول(۴.۵ µl substrate (H2O2) + 500µl DAB) DAB بمدت۲۰ دقیقه در محیط تاریک، مرطوب و دمای ۳۷ درجه انکوبه می شود.
۱۱-دوباره عمل شستشو با PBS انجام می شود.
۱۲- به وسیله ی رنگ هماتوکسیلین به مدت ۳ دقیقه رنگ آمیزی می شود.
۱۳- آبگیری در الکل های ۲۵، ۵۰، ۷۵ و ۱۰۰ درصد هر کدام ۵ دقیقه صورت می گیرد.
۱۴-شفاف سازی لام ها به وسیله ی زایلن و چسباندن توسط چسب انتلان انجام می شود.
۱۵-سپس با میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی X100 مشاهده می شود و تعداد ۱۰۰ اسپرم شمارش می شود.
سلولهای با رنگ قهوه ای تیره دارای شکستگی DNA می باشد و TUNEL+در نظر گرفته شد.
۲-۳-۶- آنالیز آماری
برای آنالیز آماری نرم افراز SPSS 15 مورد استفاده قرار گرفت. از آزمون T test - Independent Sample برای مقایسه پارامترهای سیمن قبل و بعد از شستشو استفاده شد. از تست ANOVA یک طرفه با تست تکمیلی Tukey برای مقایسه آسیب به DNA اسپرم بین گروه های مختلف استفاده شد. جهت بررسی بین زمان انکوباسیون و آسیب DNA اسپرم آزمون Pearson خطی مورد استفاده قرارگرفت. فرضیه ما دو دامنه بوده است. سطح معنا داری برای P value کمتر از ۰۵/۰ در نظر گرفته شد.

فصل سوم
نتایج
۳-۱- نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی تحرک اسپرم
در زمان قبل از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up ، درصد میانگین حرکت سریع اسپرم ۵۷/۲±۴۸/۲۰ بود و پس از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up ، درصد میانگین حرکت سریع اسپرم به ۲۷/۳±۵۲/۴۲ افزایش یافت.
اختلاف درصد میانگین حرکت سریع بعد از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up نسبت به قبل از آماده سازی بطور معنی دار افزایش یافته بود(۰۰۰۱/۰P < ).
قبل از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up بیشترین مقدار حرکت سریع اسپرم ۴۸ درصد و کمترین مقدار آن ۳ درصد و بعد از Direct Swim-up بیشترین مقدار حرکت سریع اسپرم ۶۲ درصد و کمترین مقدار ۸ درصد اندازه گیری شد.
همچنین در زمان قبل از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up ، درصد میانگین حرکت کند اسپرم ۳۰/۲±۲۴/۴۳ بود و پس از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up ، درصد میانگین حرکت کند اسپرم به ۸۰/۳±۷۱/۴۷ افزایش یافت.
از نظر آماری اختلاف معنی داری بین درصد میانگین حرکت آهسته اسپرم قبل و بعد از آماده سازی به روش Direct Swim-up وجود نداشت (۳۲۵/۰P < ).
قبل از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up بیشترین مقدار حرکت کند اسپرم ۶۳ درصد و کمترین مقدار آن ۲۴ درصد و بعد از Direct Swim-up بیشترین مقدار حرکت کند اسپرم ۸۸ درصد و کمترین مقدار ۲۷ درصد اندازه گیری شد.
قبل از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up ، درصد میانگین حرکت درجا اسپرم ۷۰۸/۰±۳۶/۵ بود و پس از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up ، درصد میانگین حرکت سریع اسپرم به ۷۵۲/۰±۲۴/۴ کاهش یافت.
اختلاف درصد میانگین حرکت درجا بعد از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up نسبت به قبل از آماده سازی از نظر آماری معنی دار نبود (۰۰۰۱/۰P < ).
قبل از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up بیشترین مقدار حرکت درجا اسپرم ۱۵ درصد و کمترین مقدار آن ۲ درصد و بعد از Direct Swim-up بیشترین مقدار حرکت درجا اسپرم ۱۵ درصد و کمترین مقدار ۱ درصد اندازه گیری شد.
تفاوت درصد میانگین اسپرم های بی حرکت قبل از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up نسبت به بعد از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up افزایش معنی داری نشان داد(۰۰۰۱/۰P <).
قبل از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up ، درصد میانگین اسپرم های بی حرکت ۶۳/۱±۸۱/۲۹ بود و پس از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up ، درصد میانگین اسپرم های بی حرکت به ۵۷۲/۰±۵۲/۵ کاهش یافت.
قبل از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up بیشترین مقدار اسپرم بی حرکت ۴۱ درصد و کمترین مقدار آن ۱۸ درصد و بعد از Direct Swim-up بیشترین مقدار اسپرم بی حرکت ۱۲ درصد و کمترین مقدار ۱ درصد اندازه گیری شد.
قبل از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up ، درصد میانگین حرکت پیشرونده اسپرم ۸۳/۱±۷۱/۶۳ بود و پس از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up ، درصد میانگین حرکت پیشرونده اسپرم به ۰۲/۱±۱۰/۹۰ افزایش یافت.
اختلاف درصد میانگین حرکت پیشرونده اسپرم بعد از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up نسبت به قبل از آماده سازی بطور معنی دار افزایش یافته بود(۰۰۰۱/۰P < ).
قبل از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up بیشترین مقدار حرکت پیشرونده اسپرم ۷۷ درصد و کمترین مقدار آن ۵۱ درصد و بعد از Direct Swim-up بیشترین مقدار حرکت پیشرونده اسپرم ۹۸ درصد و کمترین مقدار ۸۲ درصد اندازه گیری شد.
نمودار۳-۱: مقایسه میانگین حرکت پیشرونده، حرکت سریع و حرکت کند قبل و بعد از آماده سازی اسپرم به روش Swim-up
Motility %
۳-۲- نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی قابلیت حیات اسپرم
قبل از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up ، درصد میانگین قابلیت حیات اسپرم ۶۵/۱±۲۹/۸۲ بود و پس از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up ، درصد میانگین قابلیت حیات اسپرم به ۰۰۰/۰±۱۰۰ افزایش یافت.
اختلاف درصد میانگین قابلیت حیات اسپرم بعد از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up نسبت به قبل از آماده سازی بطور معنی دار افزایش یافته بود(۰۰۰۱/۰P < ).
قبل از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up بیشترین مقدار قابلیت حیات اسپرم ۹۱ درصد و کمترین مقدار آن ۷۰ درصد و بعد از Direct Swim-up مقدار قابلیت حیات اسپرم ۱۰۰ درصد اندازه گیری شد.
A
B
۳-۱- رنگ آمیزی ائوزین-نیگروزین برای سنجش میزان زنده یا مرده بودن اسپرم:A : اسپرم های که سر آن ها سفید است و رنگ به خود نمی گیرند اسپرم های زنده تلقی می شوند.B : اسپرم های که سر آن ها صورتی یا قرمز است، اسپرم های مرده تلقی می شوند.
۳-۳- نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی مورفولوژی اسپرم
اختلاف درصد میانگین مورفولوژی طبیعی اسپرم بعد از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up نسبت به قبل از آماده سازی بطور معنی دار افزایش یافته بود(۰۰۰۱/۰P < ).
قبل از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up ، درصد میانگین مورفولوژی طبیعی اسپرم ۱۰/۳±۰۰/۴۹ بود و پس از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up ، درصد میانگین مورفولوژی طبیعی اسپرم به ۵۳/۲±۳۳/۷۲ افزایش یافت.
قبل از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up بیشترین مقدار مورفولوژی طبیعی اسپرم ۷۶ درصد و کمترین مقدار آن ۳۰ درصد و بعد از Direct Swim-up بیشترین مقدار مورفولوژی طبیعی ۹۰ درصد و کمترین مقدار ۵۲ اندازه گیری شد.
نمودار۳-۲: مقایسه میانگین قابلیت حیات و مورفولوژی اسپرم قبل و بعد از آماده سازی به روش Swim-up
Viability & Morphology %
۳-۲- رنگ آمیزی پاپانیکولا باعث رنگ شدن آکروزوم و بعد از آکروزوم ، قسمت سر وقطعه میانی می شود که سر رنگ آبی وقطعه میانی به رنگ قرمز یا صورتی در می آید.
۳-۴- نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی قطعه قطعه شدن DNA اسپرم
قبل از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up ، درصد میانگین قطعه قطعه شدن DNA اسپرم ۵۹/۲±۲۴/۲۲ بود و پس از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up ، درصد میانگین قطعه قطعه شدن DNA اسپرم به ۸۰۹/۰±۳۸/۴ کاهش یافت.
اختلاف درصد میانگین قطعه قطعه شدن DNA اسپرم قبل از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up نسبت به بعد از آماده سازی بطور معنی دار افزایش یافته بود(۰۰۰۱/۰P < ).
قبل از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up بیشترین مقدار قطعه قطعه شدن DNA اسپرم ۴۳ درصد و کمترین مقدار آن ۸ درصد و بعد از Direct Swim-up بیشترین مقدار قطعه قطعه شدن DNA اسپرم ۱۷ درصد و کمترین مقدار ۱ درصد اندازه گیری شد.
نمودار۳-۳: مقایسه میانگین حرکت پیشرونده و قطعه قطعه شدن DNA اسپرم قبل و بعد از آماده سازی به روش Swim-up
Progressive
&
DNA fragmentation %
جدول۳-۱-مقایسه پارامترهای اسپرمی قبل و بعد از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up