۷۲

۱
۱
‘۳۰/۱

۳۵

Final extention

۷۲

۵

جدول۲-۵- چرخه دمایی Simplex PCR‏ ‏
۲-۸-۲-۳-انجام تست حساسیت PCR
برای شناسایی و تائید آغازگرهای گونه های خاص ۲۰ نانو گرم از DNA هر گونه (گاو،گوسفند،مرغ و سویا)تهیه شد. برای تعیین و تشخیص محدودیت هر اغازگر اختصاصی به ترتیب رقت ۱:۱۰ ( ۵۰ ، ۲۵، ۵/۰، ۰۵/۰، ۰۰۵/۰، ۰۰۰۵/۰ وng DNA /μl 00005/0) از گوشت خام (گاو،گوسفند، مرغ) و پروتئین گیاهی سویا تهیه شد و به هر رقت به طور جداگانه مخلوط واکنش اضافه گردید.

۲-۸-۲-۴- بررسی محصولات PCR
روش رایجی که برای بررسی کیفی یا کمّی، وجود یا عدم وجود و یا مقدار تولید محصول PCR استفاده می شود الکتروفورز منطقه ای یا الکتروفورز صفحه ای محصول PCR در ژل آگارز است. جهت دیدن محصول PCR در ژل باید از آگارزهای استاندارد (DNA-grade) استفاده کرد. آگارز یک پلی ساکارید است که از واحد های تکرار شونده آرابینوز دی ساکارید تشکیل شده است. هنگامی که پودر آگارز در اثر حرارت در بافر خود به حالت ژل در می آید در واقع شکل مولکول های پلیمر، از حالت حلقوی نامنظم به شکل مولکول های مارپیچی دوتایی تبدیل می شود. این پدیده یک شبکه از منافذ با قطر ۱۰۰ الی ۳۰۰ نانومتر تولید می نماید که اندازه این منافذ وابسته به عوامل متعددی است که یکی از آنها غلظت آگارز می باشد، هرچه غلظت بالاتر باشد منافذ ریزتری به وجود می آورد که قدرت تفکیک اندازه DNA مورد بررسی را کاهش می دهد.
فصل سوم

• بحث و بررسی داده های تحقیق

۳-۱-نتایج
‌کیفیت و کمّیت DNA استخراج شده از هر نمونه به ترتیب با بهره گرفتن از نانودراپ بررسی شد. با توجه به اینکه میزان جذب نوری ۲۸۰/۲۶۰ در محدوده ۸/۱ تا ۲ بوده است، لذا نشان دهنده مطلوب بودن روش استخراج DNA جهت انجام PCR ژن های مورد نظر بود. یک نمونه ازDNA استخراج شده در شکل ۳-۱ نمایش داده شده است.
شکل۳-۱-نانودراپ DNA استخراج شده
۳-۱-۱-بررسی عدم واکنش تداخلی آغازگرها (cross reaction)
در ادامه پس از استخراج DNA از نمونه های گوشت مرغ ،گوسفند،گاو و همچنین از سویای بافت دار خشک به منظور اطمینان از عملکرد اختصاصی هر آغازگر و عدم واکنش متقاطع آغازگرها،‌ آزمایش Simplex-PCR هر آغازگر با DNA های هدف و غیر هدف با سه بار تکرار انجام شد. تنها یک باند شفاف با دانسیته خوب برای نمونه DNA گاوی مشاهده شده است که نشان دهنده عدم واکنش متقاطع این آغازگر با نمونه های غیر هدف است.
شکل۳-۲-الکتروفورز محصولات PCR‏ برای آزمون اختصاصی بودن آغازگر گاوی. ۱: ( DNA گاو)، ‏‎۲: (DNA گوسفند)، ۳: (DNA مرغ)، ۴: (DNA سویا)، C- (کنترل منفی) و M نشانگر وزنی مورد استفاده (M100 bp) برای تعیین اندازه محصولات PCR.
پس از تأیید آغازگر گاوی، آزمون تأییدی PCR برای آغازگر گوسفندی با شرایط مشابه انجام گرفت و همانطور که در شکل ۳-۳ نشان داده شده است این آغازگر نیز به طور اختصاصی تنها به نمونه DNA گوسفندی متصل شد و آنرا تکثیر نمود.
شکل۳-۳-الکتروفورز محصولات PCR‏ برای آزمون اختصاصی بودن آغازگر گوسفندی. ۱: ( DNA گوسفند)، ‏‎۲: (DNA گاو)، ۳: (DNA مرغ)، ۴: (DNA سویا)، C- (کنترل منفی) و M نشانگر وزنی مورد استفاده(M100 bp) برای تعیین اندازه محصولات PCR.
پس از تأیید آغازگر گوسفندی در ادامه آزمون تأییدی PCR برای اختصاصی بودن آغازگر سویا با شرایط مشابه انجام گرفت و همانطور که در شکل ۳-۴ نشان داده شده است این آغازگر نیز به طور اختصاصی تنها باDNA سویا واکنش می دهد و هیچ گونه تمایلی برای اتصال به دیگر DNA ها ندارد.
شکل۳-۴-الکتروفورز محصولات PCR‏ برای آزمون اختصاصی بودن آغازگر سویا. ۱: ( DNA سویا)، ‏‎۲: (DNA گاو)، ۳: (DNA گوسفند)، ۴: (DNA مرغ)، C- (کنترل منفی) و M نشانگر وزنی مورد استفاده (M100 bp) برای تعیین اندازه محصولات PCR.
پس از تأیید آغازگرهای گاوی، گوسفندی و سویا، آنالیز PCR برای تأیید اتصال اختصاصی آغازگر مرغی با شرایط مشابه با دیگر آنالیزهای PCR انجام گرفت و همانطور که در شکل ۳-۵ نشان داده شد، این آغازگر نیز همانند سه آغازگر طراحی شده دیگر به طور اختصاصی تنها به نمونه DNA مرغی متصل شد و آنرا تکثیر نمود.
شکل۳-۵-الکتروفورز محصولات PCR‏ برای آزمون اختصاصی بودن آغازگر مرغی. ۱: ( DNA سویا)، ‏‎۲: (DNA گاو)، ۳: (DNA گوسفند)، ۴: (DNA مرغ)، C- (کنترل منفی) و M نشانگر وزنی مورد استفاده (M100 bp) برای تعیین اندازه محصولات PCR.
۳-۱-۲-آنالیز تأییدی PCR با آغازگرهای مختلف
در ادامه پس از تأیید عدم واکنش متقاطع آغارگرهای طراحی شده، برای تمامی ۲۰ نمونه DNA تخلیص شده از کباب لقمه های تهیه شده در سطح شهر تهران آنالیز PCR در هر مرحله با یکی از آغازگرها انجام شد.
۳-۱-۲-۱- PCR باآغازگر اختصاصی گاو
در این مرحله ابتداعاً آزمون PCR به منظور تایید وجود گوشت قرمز گاوی با آغازگر اختصاصی ژن سیتوکروم b گونه گاوی بر روی DNA های استخراج شده از نمونه های کباب لقمه های تهیه شده از سطح شهر تهران انجام گرفت. همانطور که در شکل ۳-۶ نشان داده شده است، تکثیر قطعه bp 274 ژن سیتوکروم b در تمامی نمونه های مورد مطالعه، حاکی از وجود گوشت قرمز گاوی در تمام نمونه ها بود. اگرچه در نمونه شماره ۱۸ شفافیت باند نشان از کمتر بودن میزان گوشت قرمز گاوی در نمونه تهیه شده دارد ولی همین باند کمرنگ نیز تأییدی بر وجود این ماده در کباب
لقمه تهیه شده می باشد. همچنین آغازگرهای گوسفندی، مرغی و سویا نیز به DNA اتصال نیافته و آغازگر به طور اختصاصی تنها به DNA های گاوی اتصال پیدا کرده است و واکنشPCR انجام یافته است.
شکل۳-۶-الکتروفورز محصولات PCR‏ برای آزمون تأییدی وجود گوشت قرمز گاوی در نمونه های کباب لقمه های تهیه شده در سطح شهر تهران. M نشانگر وزنی مورد استفاده (M100 bp) برای تعیین اندازه محصولات PCR، چاهک A-D به ترتیب A (DNA مرغ)، ‏‎B (DNA گوسفندی)، C (DNA گاوی)، D (DNA سویا)، C- (کنترل منفی) و به ترتیب نمونه های ۱ تا ۲۰. چاهک های ۱۰-۱ نمونه های صنعتی، چاهک های ۲۰-۱۱ نمونه های دست ساز می باشد.
۳-۱-۲-۲- PCR باآغازگراختصاصی گوسفند
پس از تأیید وجود گوشت قرمز گاوی در تمام نمونه ها در این مرحله آزمون PCR به منظور تایید وجود گوشت قرمز گوسفندی با آغازگر اختصاصی ژن سیتوکروم b گونه گوسفندی بر روی DNA های استخراج شده از نمونه های کباب لقمه انجام گرفت (شکل ۳-۷). تکثیر قطعهbp236 ژن سیتوکروم b در ۱۳ نمونه مورد مطالعه، حاکی از وجود گوشت گوسفند در آنها بود. از بین نمونه ها در ۶ نمونه دست ساز و ۷ نمونه صنعتی علیرغم برچسب اعلان شده بر روی نمونه ها حاوی گوشت قرمز گوسفندی بود.
شکل۳-۷-الکتروفورز محصولات PCR‏ برای آزمون تأییدی وجود گوشت قرمز گوسفندی در نمونه های کباب لقمه های تهیه شده در سطح شهر تهران. M نشانگر وزنی مورد استفاده (M100 bp) برای تعیین اندازه محصولات PCR، چاهک های A-D به ترتیب:A(DNA مرغ)،‏‎B (DNA گاو)، C (DNAگوسفند)، D (DNA سویا)، C- (کنترل منفی) و به ترتیب نمونه های ۱ تا ۲۰، چاهک های ۱۰-۱ نمونه های صنعتی، چاهک های ۲۰-۱۱ نمونه های دست ساز می باشد.
۳-۱-۲-۳- PCR باآغازگراختصاصی مرغ
در ادامه آزمون PCR به منظور تایید وجود مرغ با آغازگر اختصاصی ماکیان ویژه ناحیه ۱۲s rRNAبر روی DNA های استخراج شده از تمامی نمونه های کباب لقمه تهیه شده از سطح شهر تهران انجام گرفت (۳-۸). تکثیر قطعه bp 183 در نمونه مورد مطالعه، حاکی از وجود گوشت مرغ در ۳ نمونه دست ساز و ۱۰ نمونه صنعتی علیرغم برچسب اعلان شده بر روی نمونه ها بود.
شکل۳-۸- الکتروفورز محصولات PCR‏ برای آزمون تأییدی وجود گوشت مرغ در نمونه های کباب لقمه های تهیه شده در سطح شهر تهران. به ترتیب نمونه های ۱ تا۲۰ چاهک ۱۰-۱ نمونه های صنعتی و چاهک ۲۰-۱۱ نمونه های دست ساز، چاهک های A-D به ترتیب :A (DNA مرغ)، ‏‎B (DNA گوسفندی)، C (DNA گاو)، D (DNA سویا)، C- (کنترل منفی) و M نشانگر وزنی مورد استفاده (M100 bp) برای تعیین اندازه محصولات PCR.
۳-۱-۲-۴- PCR با آغازگر اختصاصی سویا
پس از اتمام آنالیز PCR برای آغازگرهای گاوی، گوسفندی و مرغی، آنالیز PCR برای آغازگر سویا انجام شد (۳-۹). با توجه به شکل نتایج حاصل از انجام PCR با آغازگر اختصاصی ژن لکتین سویا، حاکی از تکثیر قطعه bp 118 در ۵ مورد از نمونه های صنعتی مورد مطالعه بود. این یافته، نشان دهنده جایگزینی پروتئین سویا در بخشی از نمونه های کباب لقمه های تهیه شده در سطح شهر تهران مورد مطالعه، به عنوان قسمتی از گوشت قرمز مصرفی در محصول و آشکارسازی تقلب در محصولات عرضه شده به بازار بر خلاف برچسپ حک شده بر روی آن ها و عدم رعایت حقوق مصرف کننده می باشد.
شکل۳-۹-الکتروفورز محصولات PCR‏ برای آزمون اختصاصی بودن آغازگر لکتین سویا در نمونه های کباب لقمه های تهیه شده در سطح شهر تهران. به ترتیب چاهک های ۱۰-۱ نمونه های صنعتی و چاهک های ۲۰-۱۱ نمونه ها دست ساز ،چاهک های A-D به ترتیب: A (DNA مرغ)، ‏‎B (DNA گوسفندی)، C (DNA گاوی)، D (DNA سویا)، C- (کنترل منفی) و M نشانگر وزنی مورد استفاده (M100 bp) برای تعیین اندازه محصولات PCR.
۳-۱-۲-۵-حساسیت پرایمرهای اختصاصی
تشخیص محدودیت روش خاص PCR بوسیله توسعه DNA استخراج شده از هر گونه اندازه گیری گردید. حساسیت این آزمایش ۰۵/۰ نانوگرم برای هر گونه تعیین شد.