عملیات داشت
در طول مدت اجرای طرح، که به مدت ۸ هفته به طول انجامید، مقدار رطوبت گلدانها در حد ۸۰ درصد ظرفیت مزرعه ثابت نگه داشته شد. همچنین پس از سبز شدن بذور، اقدام به تنک کردن گردید و تعداد گیاهچههای ذرت و آفتابگردان، به ۴ عدد در هر گلدان کاهش یافت (شکل ۳-۱).
شکل ۳‑۱- نمایی از گلدانهای آزمایش در طول فصل رشد
برداشت نهایی و نمونه برداری از خاک و ریشه
برداشت گونههای تحت کشت، هشت هفته پس از کاشت صورت گرفت. در نمونه برداری، گیاهان ذرت وآفتابگردان از یک سانتیمتری سطح خاک با دقت قطع گردیدند و در داخل پاکت کاغذی شمارهدار ریخته شده و به آزمایشگاه منتقل شدند. سپس بمدت ۴۸ ساعت در دستگاه آون، در حرارت ۷۵ درجه سانتیگراد نگهداری شدند تا کاملاً خشک شوند. پس از این مدت از آون خارج و پس از گذشت مدت زمان بیست دقیقهای جهت رسیدن به تعادل دمایی با محیط، با ترازوی حساس با دقت ۰۱/۰ گرم توزین شدند.
اندازه گیری درصد کلونیزاسیون ریشه
به منظور اندازه گیری درصد همزیستی میکوریزی، ابتدا پس از برداشت، مقداری ریشه (با قطر کمتر از یک میلیمتر) جدا شد و در الکل۵۰ درصد نگهداری گردید. برای رنگآمیزی ریشهها در محیط آزمایشگاه از روش تغییریافته فیلیپس و هیمن (۱۹۷۰) استفاده شد. بدین جهت، ابتدا ریشهها را کاملا شسته و به مدت ۲۴ ساعت در محلول KOH 10 درصد در دمای اتاق قرار داده شد. سپس ریشهها، سه بار با آب مقطر شسته شده و برای خنثی کردن محیط قلیایی به مدت دو دقیقه در محلول HCl یک دهم نرمال قرار گرفتند. در مرحله بعد، ریشهها، به مدت ۲۴ ساعت در محلول تریپان بلو (شامل ۲۲۵ میلی لیتر اسیدلاکتیک، ۳۵۰ میلی لیتر گلیسیرین، ۴۰۰ میلی لیتر آب مقطر، ۶۵/۰ گرم رنگ تریپان بلو)، جهت رنگ آمیزی قرار داده شدند. بهمنظور نگهداری طولانی مدت ریشهها، از محلول گلیسیرین + اسید لاکتیک استفاده گردید. برای تعیین درصد کلونیزاسیون نیز از روش جییووانی و موس (۱۹۸۰) استفاده گردید. ریشه های مویین به قطعات یک سانتیمتری تقسیم شدند و در نهایت با میکروسکوپ با بزرگنمایی ۴۰ مشاهده (شکل ۳-۲) و درصد کلونیزاسیون از رابطه زیر محاسبه شد:
۱۰۰*(تعداد قطعات مشاهده شده/تعداد قطعات آلوده شده به میکوریز ) = درصد کلونیزاسیون
شکل ۳‑۲- نمایی از ریشه در زیر میکروسکوپ
اندازه گیری EC و pH در سوسپانسیون خاک
به منظور بررسی تغییرات اسیدیته و هدایت الکتریکی خاک در گلدانها، پس از برداشت گیاهان یک نمونه ۱۰۰ گرمی از خاک هر گلدان تهیه و به آزمایشگاه انتقال داده شد. سپس عصاره از خاک با نسبت ۱به ۵/۲ تهیه گردید. سپس با بهره گرفتن از دستگاه EC متر و pH متر، میزان EC و pH اندازه گیری شد.
اندازه گیری فسفر محلول
غلظت فسفر محلول با بهره گرفتن از دو معرف مولیبدات آمونیم و کلرید قلع اندازه گیری شد. برای تهیه معرف مولیبدات آمونیم، ۲۵ گرم (NH4)6MoO24.4H2O در ۱۷۵ میلیلیتر حل گردید، سپس ۲۸۰ میلی لیتر اسید سولفوریک غلیظ به آن افزوده شد. پس از سرد شدن، محلول به حجم ۱ لیتر رسانیده شد. بهمنظور تهیه معرف کلرور قلع، ۵/۲ گرم SnCl2.2H2O در ۱۰۰ میلی لیتر گلیسرول حل گردید. از KH2PO4 نیز برای تهیه محلول استاندارد فسفر استفاده شد. در این روش، بر روی ۲۰ میلی لیتر نمونه، ۲ میلی لیتر معرف مولیبدات آمونیم و ۵ قطره معرف کلرور قلع افزوده شد. پس از گذشت ۱۰ دقیقه به کمک دستگاه اسپکتروفوتومتر مدل Jenway 6305 غلظت فسفر نمونهها تعیین گردید (سعو و همکاران، ۲۰۰۰)
اندازه گیری فسفر قابل جذب خاک به روش اولسن
برای اندازه گیری فسفر قابل جذب خاک از روش اولسن استفاده گردید (اولسن، ۱۹۵۴). بدین منظور مقدار ۴۲ گرم بیکربنات سدیم خالص (NaHCO3) را در یک لیتر آب مقطر تازه تهیه شده حل کرده و با اضافه کردن سود یا اسید کلریدریک، pH آن در ۵/۸ تنظیم شد. جهت عصاره گیری خاک، مقدار ۱ گرم خاک الک شده وزن گردید و ۵/۰ گرم پودر زغال اکتیو عاری از فسفر به آن افزوده و در ارلن مایر ۵۰ سی سی قرار گرفت. سپس ۲۰ میلی لیتر از محلول بیکربنات سدیم به آن اضافه کرده و به مدت ۳۰ دقیقه در شیکر افقی با سرعت ۲۰۰ نوسان در دقیقه قرارگرفتند. محلول بدست آمده را از کاغذ صافی واتمن ۴۲ عبور داده و صاف گردید.
ساخت محلولهای شیمیایی لازم
به منظور تهیه محلول Reagent A، ابتدا ۱۲ گرم مولیبدات آمونیوم را در ۲۵۰ میلیلیتر آب مقطر حل گردید. همچنین مقدار ۲۹۱/۰ گرم پتاسیم آنتیمونی تارتارات را در۱۰۰ میلیلیتر آب مقطر حل شد. ۷۴ میلیلیتر اسید سولفوریک غلیظ را به آرامی به ۵۰۰ میلیلیتر آب مقطر اضافه کرده، پس از سرد شدن محلول اسید سولفوریک، هر سه محلول را با هم مخلوط کرده و به حجم ۱ لیتر رسانده شد.
برای تهیه محلول Reagent B، مقدار ۰۵۵۶/۱ گرم اسید اسکوربیک در ۲۰۰ میلیلیتر از محلول Reagent A حل گردید. میزان ۶/۰ میلی لیتر از محلول عصاره نمونه خاک و محلولهای استاندارد، ۲ میلی لیتر آب مقطر و ۶/۰ میلی لیتر از محلول Reagent B را در کووت ریخته و پس از گذشت ۱۰ دقیقه، نمونهها با دستگاه اسپکترو فوتومتر مدل Jenway 6305 در طول موج nm882 اندازه گیری شد.
ساخت محلول استاندارد
برای تهیه محلول ۱۰۰ ppm فسفر، مقدار ۴۳۹۴/۰ گرم پتاسیم دی هیدروژن فسفات را در یک لیتر آب مقطر حل می شود. ۲۰ میلی لیتر از محلول ppm 100 فسفر را برداشته و به حجم ۲۰۰ میلیلیتر رسانده تا محلول ppm 10 فسفر ساخته شود.
به ترتیب مقادیر ۱۰، ۲، ۱، ۲/۰، ۱/۰، ۰۲/۰ از محلول ppm 10 فسفر برداشته و به حجم ۲۰ میلیلیتر رسانده شد. بدین ترتیب غلظت فسفر با بهره گرفتن از یک منحنی استاندارد تعیین گردید.
اندازه گیری میزان فسفر در بافت گیاهی (اندام هوایی و ریشه)
برای اندازه گیری میزان فسفر در بافت گیاهی، از روش هضم تر با اسید پرکلریک و اسید نیتریک استفاده شد (هانسون، ۱۹۵۰؛ کیستون و همکاران، ۱۹۴۴). بدین جهت ابتدا مقدار ۵۰۰ میلیلیتر اسید نیتریک غلیظ با ۸۳ میلیلیتر اسید پرکلریک ۷۰ % (نسبت ۶ به ۱) مخلوط گردید. مقدار ۵/۰ گرم نمونه گیاهی خرد شده، وزن و در لوله های هضم قرار داده شد. سپس مقدار ۷ میلیلیتر از محلول اسید نیتریک و اسید پرکلریک در لولههای هضم ریخته و نمونه ها بهمدت یک شب در محلول قرار گرفتند. در نهایت به مدت ۴ ساعت در دمای ۱۵۰ درجه سانتی گراد و ۱ ساعت در دمای ۲۰۰ درجه سانتی گراد و ۲ ساعت در دمای ۲۲۵ درجه سانتی گراد قرار گرفتند. سپس عصاره بدست آمده به حجم ۵۰ میلیلیتر رسانده شد.
تهیه محلول شیمیایی
مقدار ۵/۲ گرم آمونیوم وانادات در یک لیتر آب حل گردید.۵۰ گرم آمونیوم مولیبدات در یک لیترآب حل شد و سپس با یک لیتر اسید نیتریک مخلوط شدند.
تهیه محلول استاندارد
برای تهیه محلول استاندارد ۱۰۰۰ پیپیام فسفر مقدار ۳۹۳۷/۴ گرم از پتاسیم دی هیدروژن فسفات را در آب حل و به حجم یک لیتر رساندیم. ۲۰ میلیلیتر از محلول استاندارد ۱۰۰۰ پیپیام را به بالن ژوژه ۱ لیتری منتقل و به حجم رساندیم. این محلول استاندارد ۲۰ پیپیام در لیتر فسفر میباشد.
میزان ۰،۱۰،۲۰،۳۰،۴۰،۵۰،۶۰،۹۰ میلیلیتر از محلول استاندارد ۲۰ میکروگرم در لیتر را به بالن ژوژه ۱ لیتری منتقل کرده و سپس میزان ۸ میلیلیتر از محلول آمونیوم مولیبدات - وانادات - اسید نیتریک اضافه کرده و به حجم ۱۰۰ رسانده شد. این سری محلولها حاوی ۰،۵،۱۰،۱۵،۲۰،۲۵،۳۰،۴۵ میلیگرم در لیتر فسفر هستند که در رسم منحنی کالیبراسیون استفاده گردید.
تهیه نمونهها
مقدار ۸/۰ میلیلیتر از محلول آمونیوم مولیبدات - وانادات - اسید نیتریک و ۷/۰ میلیلیتر عصاره گیاه با آب مقطر به حجم ۱۰ میلیلیتر رسانده شد. این محلول را در کووت ریخته و بعد از ۳۰ دقیقه در طول موج ۳۹۰ نانومتر با دستگاه اسپکتروفوتومتر اندازه گیری شد.
اندازه گیری میزان سرب گیاه
برای اندازه گیری میزان سرب در بافت گیاهی نیز، از روش هضم تر با اسید پرکلریک و اسید نیتریک استفاده شد که در بخش ۳-۹ بیان گردید. غلظت سرب موجود در اندام هوایی و ریشه گیاه در عصاره حاصل توسط دستگاه جذب اتمی قرائت گردید.
اندازه گیری میزان سرب محلول و تبادلی خاک
برای استخراج میزان سرب محلول و تبادلی در خاک، از عصاره گیر MgCl2 یک مولار استفاده گردید. بدین منظور به ۴ گرم خاک، ۳۲ میلیلیتر MgCl2 (با نسبت ۱:۸) اضافه شد. نمونهها به مدت یک ساعت در شیکر با سرعت ۲۵۰ دور بر دقیقه قرار گرفت. سپس بعد از ۳۰ دقیقه سانتریفیوژ کردن با دور ۵۰۰۰ دور بر دقیقه، اقدام به عصاره گیری شد (تسیر، ۱۹۷۹).
تجزیه و تحلیل آماری دادهها
به منظور تجزیه و تحلیل آماری دادههای بدست آمده در این پژوهش، از نرمافزار MSTATC استفاده گردید. همچنین رسم شکلها با نرمافزار Excel و کلیه مقایسه میانگین با آزمون حداقل اختلاف معنیدار (LSD) و در سطح احتمال ۵ درصد انجام پذیرفت.
فصل چهارم
گیاه ذرت
وزن خشک اندام هوایی
تجزیه واریانس داده ها (جدول ۴-۱ واقع در پیوست) نشان میدهد فاکتور کودهای فسفره، بر وزن خشک اندام هوایی گیاه ذرت معنی دار شده است (۰۱/۰≥ρ). همچنین قابل ذکر است تاثیر میکوریز بر وزن خشک اندام هوایی گیاه معنی دار نشده است. با توجه به مقایسه میانگینها تنها کاربرد کود دی آمونیوم فسفات در خاک آلوده به سرب توانست وزن خشک اندام هوایی گیاه ذرت را نسبت به سایر کودهای فسفره افزایش معنی دار دهد و اثر مابقی کودهای فسفره از لحاظ آماری معنی دار نشده است (شکل ۴-۱). طبیعی است که افزودن کودهای فسفره سبب رشد بهتر گیاه شده و دی آمونیوم فسفات نسبت به پودر استخوان به دلیل حلالیت بیشتر فسفر موجود در آن توانسته است که وزن خشک گیاه را افزایش دهد. محمدی ثانی (۱۳۸۸) در پژوهش خود بیان کرد تامین فسفر مورد نیاز گیاه به وسیله کود پایه، دلیل افزایش وزن زیست توده گیاه گندم را می توان در تثبیت عنصر سرب به وسیله فسفر در خاک آلوده و تشکیل کانیهای کم محلول فسفره سرب دار نظیر پیرومورفایت دانست. به نظر میرسد که تشکیل کانیهای کم محلول فسفر با سرب سبب کاهش قابلیت دسترسی سرب برای گیاه شده و از سمیت آن برای گیاه کاسته می شود (زو و همکاران، ۲۰۰۳؛ زورپاس و همکاران، ۲۰۰۰).
شکل ۴‑۱- تاثیر کاربرد کودهای مختلف فسفره بر وزن خشک اندام هوایی گیاه ذرت
وزن خشک ریشه
تجزیه داده های آزمایش نشان میدهد اثرات اصلی قارچ میکوریز و فاکتور کود فسفره بر وزن خشک ریشه گیاه ذرت در سطح احتمال ۱ درصد معنی دار هستند (جدول ۴-۱). کاربرد قارچ میکوریز با اثر مثبت خصوصیات رشدی گیاه توانست در این آزمایش وزن خشک ریشه گیاه ذرت را نسبت به عدم کاربرد آن بهبود ببخشد و افزایش معنی دار دهد. وامرالی و همکاران (۲۰۰۳) بیان کردند با افزایش جذب آب و مواد غذایی به وسیله قارچ میکوریز، کربن اختصاص یافته به ریشه بیشتر می شود. فنگ و همکاران (۲۰۰۲) در تحقیق خود بر تأثیر قارچ میکوریز روی وزن خشک ریشه ذرت، مشاهده کردند که وزن خشک ریشه در نتیجه همزیستی با میکوریز جنس گلوموس افزایش یافت. آنها دلیل این امر را افزایش ظرفیت فتوسنتزی گیاهان میکوریزی و در نتیجه افزایش غلظت کربوهیدرات های محلول در ریشه دانستند. دوپونویس و همکاران (۲۰۰۵) بیان کردند تلقیح با میکوریز گونه G. interadices سبب افزایش ماده خشک اندام هوایی و ریشه گیاه آکاسیا شده است. علیزاده و همکاران (۱۳۸۸) در بررسی خود، بیشترین وزن خشک ریشه گیاه ذرت را در حضور قارچ میکوریز گزارش کردند. در واقع نتایج حاصل از این تحقیق حاکی از آن است که استفاده از قارچ میکوریز ضمن آنکه باعث کاهش سمیت سرب میگردد، از سوی دیگر موجب افزایش تحمل گیاه نسبت به آلودگی نیز میشود. به نحوی که افزایش وزن خشک گیاه در تیمار تلقیح با میکوریز نسبت به شاهد بارز و معنی دار میباشد.
در بین کاربرد کودهای مختلف فسفره تنها کود شیمیایی دی آمونیوم فسفات وزن خشک ریشه گیاه ذرت را نسبت به شاهد افزایش معنی دار داد (شکل ۴-۲). در مطالعه دیگری که از منابع مختلف فسفر از جمله سوپر فسفات تریپل در خاکهای آلوده به سرب و روی استفاده شده بود افزایش معنی دار وزن خشک ریشه و اندام هوایی مشاهده شد ( رایسویک و همکاران، ۲۰۰۴؛ کمپاین و همکاران، ۲۰۰۷). میگناردی و همکاران (۲۰۱۲) اذعان داشتند با بهره گرفتن از تیمار سنگ فسفات در خاک آلوده به عناصر سنگین، وزن خشک ریشه و اندام هوایی افزایش پیدا کرد. بنابراین کاربرد کودهای شیمیایی فسفره با دارا بودن فسفر محلول سبب کاهش حلالیت سرب در خاکهای آلوده به این فلز می شود و ضمن فراهم کردن فسفر مورد نیاز گیاه سبب افزایش بیومس ریشه این گیاهان نسبت به گیاهان شاهد شده و در نتیجه افزایش وزن خشک ریشه این گیاهان را به همراه دارد.
