بحث و نتیجه گیری
بحث
سیاه سرفه یکی از خطرناک ترین بیماری های کودکان بخصوص در سنین زیر یک سال است. این بیماری توسط یک باکتری به نام بوردتلاپرتوسیس ایجاد می شود.
این باکتری سبب انسداد مجاری هوایی توسط ترشحات مخاطی (موکوس) می گردد. شروع این بیماری به صورت یک سرماخوردگی معمولی همراه با سیاه سرفه است. به تدریج سرفه ها شدیدتر شده و به صورت حمله­ای بروز می کنند و سبب دشواری تنفس می گردند.
موجود زنده، مانند بدن انسان به خودی خود نیروی مقاومت و غلبه یافتن بر میکروب ها را دارد . این حالت را «مصونیت» می­نامند. اما در برخی از موارد باید بدن را از خارج کمک کرد، تا چنین مصونیتی را پیداکند. واکسن دارای میکرب بیماری است که البته آنرا ضعیف و بی آزار ساخته اند واکسن از پی تزریق در بدن انسان «پادزهر» درست می­ کند که با ویروس بیماری وارد نبرد می شوند و آنها را خنثی میکنند.
واکسن ها از میکروب یا ویروس کشته شده و یا ضعیف شده که عوامل بیماری های خاص هستند ساخته شده ­اند. با تزریق واکسن سیستم ایمنی تحت حمله این میکروب ها و یا ویروس ها قرار می گیرد و در نتیجه ترشح آنتی بادی ها یا پادتن ها در بدن بالا می رود(۶۰).
این آنتی بادی­ها در بدن کودک فعال باقی می مانند و در صورتیکه بدن با بیماری واقعی مواجه شود آن را در مقابل آن ویروس یا میکروب محافظت می­ کنند. بعنوان مثال اگر بیماری سیاه سرفه در منطقه­ای شایع شود احتمال ابتلا کودکی که واکسینه شده است به مراتب کمتر از کودکی است که واکسینه نشده است. واکسیناسیون اقدام بسیارمهم و با ارزشی است که بوسیله آن با هزینه کم می­توان از ابتلاء به بیماری های عفونی جلوگیری کرد. با اجرای برنامه واکسیناسیون همگانی در جهان، شیوع بسیاری از بیماری های خطرناک در بین نوزادان، کودکان و بالغین کاهش بارزی پیدا کرده است بطوریکه اکنون شیوع بیماری های خطیری چون دیفتری، کزاز، سیاه سرفه، سرخک و فلج کودکان با واکسیناسیون همگانی با موفقیت کنترل و در بسیاری از کشورها عملاً به حداقل میزان خود رسیده است ، یا بیماری آبله که با واکسیناسیون همگانی و پیگیری جهانی ریشه کن شده است.
امروزه با تزریق واکسن سیاه سرفه شیوع این بیماری کاهش یافته است. پیشگیری ازبیماری های عفونی بوسیله واکسن یکی از پیروزی های مهم علم پزشکی است،. هدف در تهیه واکسن مناسب ، رسیدن به مرحله ای است که واکسن حداکثر اثر پیشگیری را با حداقل عارضه جانبی داشته باشد.
واکسن سیاه سرفه به طور معمول همراه با واکسن های دیفتری و کزاز تجویز می شود. این واکسن که به نام واکسن DTP موسوم است در ۲ ماهگی، ۴ ماهگی و ۶ ماهگی تزریق می شود و در ۱۸ ماهگی و در سنین ۶-۴ سالگی یادآور آن تزریق می شود. واکسن سه گانه DTP با بهره گرفتن از باکتری کشته شده سیاه سرفه و نازهر^[۱۴۰] باکتری های دیفتری و کزاز ساخته می شود. دیفتری، کزاز و سیاه سرفه بیماری های خطرناکی هستند که می توانند موجب مرگ یا عوارض شدید شوند.
در مؤسسه واکسن و سرم سازی رازی تهیه واکسن سیاه سرفه از سال ۱۹۴۹ با کشت باکتری روی آگار بورده-ژانگو شروع شد. سپس محیط های مایع کوهن-ویلر و محیط B₂ جایگزین محیط جامد برای کشت باکتری گردید. از آن به بعد ترسیب با اسید کلریدریک، غیر فعال سازی با گرما، متعاقب با ۱۲-۹ ماه سمیت زدایی با تیومرسال در درجه حرارت ۸-۴ درجه سانتیگراد مراحل مختلف تولید واکسن بودند(۴).

در این پروژه از شش بچ ۱۳۴ و شش بچ ۵۰۹ برای تولید واکسن تجربی استفاده شد که بعد از گذراندن مراحل کشت، غیر فعال سازی باکتری با بهره گرفتن از حرارت در دمای ۵۶ درجه سانتیگراد به مدت ۱۰ دقیقه و از دو روش سمیت زدایی با بهره گرفتن از فرمالین و تیومرسال استفاده گردید.
مدت زمان انکوباسیون در بچ­های مختلف متفاوت بود، نتایج حاصله نشان داد، مدت زمان انکوباسیون در هر دو روش سمیت زدایی بوسیله تیومرسال و فرمالین در سویه ۵۰۹ نسبت به سویه ۱۳۴ کوتاه تر است.
علاوه بر کنترل واکسن برای عدم حضور توکسین­های ناپایدار در مقابل حرارت، سوسپانسیون باکتری باید از نظر توکسین­های مقاوم به حرارت که به طور عمده در سوپرنتانت کشت موجود بود مورد ارزیابی قرار گیرد.
چندین روش برای سمیت زدایی و غیر فعال سازی سوسپانسیون سلولی باکتری سیاه سرفه وجود دارد که از آن جمله می توان به سمیت زدایی با تیومرسال، سمیت زدایی با فرمالین، سمیت زدایی با گلوتارآلدهید، سمیت زدایی با استون و غیر فعال سازی توسط حرارت به تنهایی یا همراه با روش­های شیمیایی مذکور نام برد.
گرما در دمای ۵۶ درجه سانتیگراد به مدت ۱۰دقیقه، فرمالدهید با غلظت ۱/۰% در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد بمدت ۲۴ ساعت، گلوتارآلدهید با غلظت ۰۵/۰ % در دمای اتاق به مدت ۱۰ دقیقه، تیومرسال ۰۲/۰ در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد بمدت ۲۴ ساعت، استون در دمای معمولی یا در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد بعنوان عوامل غیر فعال کننده در تهیه سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه در تحقیقات مختلف مورد استفاده قرار گرفتند (۶۸) که در این پروژه از روش غیر فعال سازی باکتری سیاه سرفه در دمای ۵۶ درجه سانتیگراد به مدت ۱۰ دقیقه استفاده شد و دو روش سمیت زدایی با فرمالین و تیومرسال مورد ارزیابی و مقایسه قرار گرفت.
در این پروژه از شش بچ باکتری سیاه سرفه سویه های ۱۳۴ و ۵۰۹ استفاده شد و از نظر سمیت زدایی با فرمالین و تیومرسال با بهره گرفتن از تستMWG و همچنین توانمندی با بهره گرفتن از تست Kendrick مورد مقایسه قرار گرفتند.
از دو روش فیزیکی سانتریفوژ و میکروفیلتراسیون برای جداسازی سلول باکتری از محیط کشت استفاده گردید(۱۲). که روش میکرو فیلتراسیون از نظر دقت، سرعت و عدم ریسک آلودگی برای جداسازی باکتری نسبت به روش سانتریفوژ مناسب تر بود.
به دلیل اینکه سوسپانسیون جداسازی شده دارای سم ناپایدار در مقابل حرارت است سوسپانسیون ها با استفاده ازحرارت در دمای ۵۶ درجه سانتیگراد بمدت ۱۰ دقیقه در فرمانتور تحت شرایط کنترل شده از نظر دما، زمان و دور همزن غیر فعال سازی شدند. که این روش در مقایسه با بهره گرفتن از بن ماری که بصورت سنتی در مؤسسه رازی برای غیرفعال سازی استفاده می گردید روش مطمئن تر و دقیق تری بود.
درروش سمیت زدایی با فرمالین، ابتدا به سوسپانسیون ها، فرمالین با غلظت mM10 اضافه شده و بعد توسط حرارت غیرفعال شدند و سپس در دمای ۸-۴ درجه سانتیگراد انکوبه شدند در روش سمیت زدایی با تیومرسال ابتدا سوسپانسیون باکتری در درجه حرارت ۵۶ درجه سانتیگراد به مدت ۱۰ دقیقه غیر فعال شده و بعد تیومرسال با غلظتv/w 01/0 % به سوسپانسیون اضافه شده و در نهایت در دمای ۸-۴ درجه سانتیگراد انکوبه شدند.
به دلیل اینکه سمیت زدایی با تیومرسال در دمای ۸-۴ درجه سانتیگراد نیازمند انکوباسیون فرآورده به مدت طولانی می باشد و از سوی دیگر پاره ای از تحقیقات نشانگر نارسایی این روش برای غیر فعال سازی توکسین های سیاه سرفه می باشد برآن شدیم تا در این پروژه با بهره گرفتن از فرمالین مدت زمان انکوباسیون را کاهش دهیم.
با بهره گرفتن از تستMWG و تست توانمندی، سمیت زدایی سوسپانسیون سلولی باکتری سیاه سرفه و میزان توانمندی (پوتنسی) واکسن مورد ارزیابی قرار گرفت.
بر اساس استاندارد WHO آزمایشMWG به منظور تشخیص سمیت اختصاصی بر روی بچ های تولیدی مخلوط شده آنتی ژن های سیاه سرفه ۵۰۹ و ۱۳۴ انجام گردید. با انجام تست MWG در فواصل معین، زمان غیر فعال شدن توکسین توسط فرمالین و تیومرسال بدست آمد. در این تست سوسپانسیون­های واجد فرمالین بعد از ۱۰، ۳۰ و ۹۰ روز مورد بررسی قرار داده شد و سوسپانسیون­های واجد تیومرسال هم در زمان­های ۱۰، ۳۰ ، ۹۰، ۱۸۰ و۲۷۰ مورد آزمایش قرار داده شدند.
نتایج نشان داد واکسن سیاه سرفه بعد از یک ماه کاملاً توسط فرمالین سمیت زدایی شده و تیومرسال بعد از شش الی نه ماه باعث غیرفعال سازی توکسین باکتری می گردد. با توجه به نتایج حاصله مدت زمان انکوباسیون بچ های سویه ۱۳۴ کمتر از سویه ۵۰۹ بود.
انجام تستMWG نشان داد که بچ های شماره EXMG89-1، EX B89-16 ،EXB89-14 ، EXB89-13، EXB89-7 وEXB89-3 از سویه ۱۳۴ و بچ های شمارهEXB89-17 ،EXB89-12 ، EXB89-11 و EXB89-6 از سویه ۵۰۹ بعد از ۱۸۰ روز انکوباسیون از نظر رفع توکسیسیتی مورد قبول واقع شدند و تنها دو بچ EXMG89-2 و EXB89-5 از سویه ۵۰۹ بود که پس از ۲۷۰ روز انکوباسیون در ۸-۴ درجه سانتیگراد ازنظر تستMWG مورد قبول واقع شدند.
نتایج نشان داد که روش سمیت زدایی با فرمالین با میانگین دوره ۶/۲۶روز در مقایسه با روش سمیت زدایی با تیومرسال با میانگین دوره ۱۹۵ روز، روش کوتاهتری از نظر زمانی برای سمیت زدایی سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه بوده است.
در این پروژه اثبات شد که زمان سمیت­زدایی سوسپانسیون سیاه سرفه با فرمالین کمتر از تیومرسال است.
Thalen در سال ۲۰۰۸ سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه را پس از برداشت تحت تاثیرmM 10 فرمالین در حرارت ۵۶ درجه سانتیگراد به مدت ۱۰ دقیقه غیر فعال سازی و توکسین زدایی نمود. واکسن های حاصل از این روش ایمنی زایی مناسبی را بدون اثرات توکسیسیتی از خود نشان دادند که با نتایج حاصل از این تحقیق مطابقت داشت (۶۰).
در تحقیقی که توسط Munoz و Hestekin در سال ۱۹۶۶ انجام شد به بررسی سمیت زدایی سوسپانسیون­های سیاه سرفه توسط فرمالین و تیومرسال پرداخته شده است. آنها بررسی کردند سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه در مجاورت ۵/۰ درصد فرمالین در ۳۷ درجه سانتیگراد به مدت یک هفته قادر است فعالیت توکسیستی سیاه سرفه را حذف نماید در حالیکه استفاده از تیومرسال با غلظت ۱:۱۰،۰۰۰ نتوانست فعالیت توکسیستی سیاه سرفه را حذف نماید.
توانمندی واکسن حاصل از سمیت زدایی با فرمالین به میزان قابل توجهی کاهش یافت در حالیکه توانمندی واکسن تیومرسالی شرایط نرمال خود را حفظ کرده بود. در این آزمایش Munoz و همکارش نشان دادند که سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه بدون غیر فعال سازی حرارتی در حضور ۵/۰ درصد فرمالین در درجه حرارت ۵-۲ درجه سانتیگراد در طول مدت ۲۷ هفته سمیت زدایی شده و توانمندی فرآورده نسبت به زمانیکه در۳۷ درجه سانتیگراد انکوبه گردد ثبات بیشتری را نشان داد. همچنین سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه که بدون غیرفعال سازی حرارتی در معرض تیومرسال ۱:۱۰،۰۰۰ در درجه حرارت ۵-۲ درجه سانتیگراد در طول مدت ۲۷ هفته سمیت زدایی شده، از نظر حفظ ثبات ایمنی زایی شرایط بهتری را نسبت به فرمالین نشان داد که از لحاظ درجه حرارت انکوباسیون و تأثیر آن در ثبات بیشتر توانمندی واکسن با نتایج حاصل از این تحقیق مطابقت داشت (۴۴).
فرمالین به عنوان یک عامل سمیت زدایی و غیر فعال کننده برای ساختن واکسن سیاه سرفه سلولی و همچنین در تهیه واکسن غیر سلولی سیاه سرفه توصیه شده است.
این تحقیق با تحقیقات انجام شده توسط Stainer و Hartt که نشان دادند تیومرسال و استون بعنوان عوامل غیر فعال کننده برتر کشف نشده، بنابراین گلوتارآلدهید و فرمالین برای غیر فعال سازی سوسپانسیون سیاه سرفه در واکسنDTP بهتر است که توانستند با بهره گرفتن از فرمالین با روشی مشابه واکسنی توانمند برعلیه بیماری سیاه سرفه تولید نمایند تطابق داشت (۴۴).