در تحقیق” لین و همکاران” در سال ۲۰۱۲ روی پلیساکاریدهای محلول در آب گیاه حرا، آماده‌سازی پلیساکاریدهای خام رو اینجوری انجام دادن: ۳۰۰گرم پودر خشک شده ساقه و برگ رو با ۳ لیتر اتانل ۹۵% واسه ۳ ساعت در مبرد برعکس گرما دادن تا اجزای محلول‌دراتانل حذف شن. بعد مخلوط با سانتریفوژ ۲۰۰۰G واسه ۱۰ دقیقه جدا شد. باقی‌مونده ۲ دوباره به روش فوق استخراج شد و در ۵۰ درجه سانتی‌گراد واسه ۱۰ ساعت خشک شد.
زای و همکاران در سال ۲۰۱۰، جفت و جور پلیساکاریدهای برگهای چای رو اینجور توضیح داده‌ان که ۲۵۰ گرم از برگهای خشک و آسیاب شده رو با ۲ لیتر آب‌مقطر در دمای ۹۰ درجه سانتی‌گراد درحمام آب به مدت ۲ ساعت استخراج کردن. پس از صاف کردن، باقی‌مونده رو دوباره با ۵/۲ لیتر آب‌مقطر واسه ۲ ساعت دیگه استخراج کردن. بعد عصاره‌ها سانتریفوژ شدن تا آلودگی اونا جدا شه. محلول رویین با تبخیر در روتاری تغلیظ شد و با اتانل ۹۵% رسوب‌گیری شد. رسوب رو در آب حل کرده و روی اون دیالیز انجام دادن تا مولکول‌های کوچیک حذف شن. محلول دیالیزشده رو به روش انجمادی خشک کردن (۶۴).
در تایلند در سال ۲۰۱۱ “اسریچامروئن و همکارش” صمغ مغز دانه پنیرک رو به روش قلیایی استخراج کردن که در مقایسه با عصاره استخراج آبی، خواص ژل کننده بالایی داشت. اینطوری که : دانه مالوا رو تا دانه‌بندی ۵/۰میلی‌متر آسیاب کردن و به نسبت ۱ به ۱۰۰ حجمی-حجمی در آب مقطر پخش کردن. در حموم آب جوش ۵/۱ ساعت موند و محلول در دمای اتاق خنک شد و به اون NaOH در غلظتهای ۰۵/۰، ۱/۰ و ۲/۰ مولار اضافه شد و به نسبت ۱ به ۱ با اتانل خالص تیمار شد. رسوب رو حذف کردن و صمغ به pH 4/7 رسید و در دمای (۲۰-) درجه سانتی‌گراد تا زمان آزمون نگهداری کردن. صمغ استخراج شده با آب رو با نام"صمغ معمولی” با همین روش و بدون به کار گیری NaOH گرفتن غلظت ۱% وزنی-وزنی صمغ از غلظت ۵/۰% موثر‌تر بود و مخلوطی از صمغ مغز دانه گوار، تجزیه گلوکز از نشاسته رو در روند دیالیز آزمایشگاهی تا ۵۰-۸۲% در مقایسه با تماشاگر کم کرد و مخلوط مغز دانه مالوا و گوار کاهش بالاتری (۳ تا ۷ برابر) رو در تجزیه ۱۵ الی نیم ساعت‌ای نشون دادن (۵۶).
درتحقیق سال ۲۰۱۱ “زاهدی و همکاران “برگهای گیاه مالوا رو جدا کرده و در ۶۰ درجه سانتی‌گراد خشک کردن. برگهای خشک شده رو آسیاب کردن و در آب‌مقطر به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۲۵ درجه سانتی‌گراد قرار دادن(واسه گرفتن غلظتهای ۵/۲، ۵، ۵/۷ و ۱۰ گرم از برگ خشک در ۱۰۰ میلی لیتر آب‌مقطر) آب‌مقطر رو به عنوان تماشاگر در نظر گرفتن. بعد از خیساندن محلول رو، در تنظیف ۴ لایه‌ای صاف کردن و صاف شده ۴ ساعت سانتریفوژ شد(دور سانتریفوژ گزارش نشده). سوپرناتانت رو دوباره با به کار گیری فیلتر ۲/۰ میلی‌متری صاف کردن (۶۴).
در مقاله “کانگ و زیا “در سال۲۰۱۳، استخراج پلی‌ساکارید E.sinica به روش زیر انجام شده:
ریشه های خشک E.sinica رو پودر کردن. یه کیلوگرم پودر خشک رو با ۱۰ حجم اتانل ۹۵% زیر مبرد برعکس، هر بار به خاطر حذف لیپیدها به مدت ۳ ساعت مخلوط کردن.
پس از ۳ بار استخراج، باقی‌مونده رو در هوای آزاد خشک کرده و بعد با ۱۰ حجم آب‌مقطر هر بار، واسه ۲۴ ساعت در ۴ درجه سانتی‌گراد استخراج کردن. استخراج‌های آبی رو صاف کرده و تا۱۰ بار تغلیظ کردن وبا اتانل ۹۵% تا ۸۰% غلظت پایانی اضافه کردن.
رسوب رو در ml600 آب حل کرده و ۱۵ بار با ml 200 محلول ۵:۱ از کلروفرم :n- بوتانل طبق روش ساتوب، پروتئین زدایی کردن.
جدا شده آبی حاصل رو با آب معمولی واسه ۴۸ ساعت و با آب مقطر واسه ۴۸ ساعت به طور کامل دیالیز کردن (کات آف جرم مولکولی ۳۵۰۰ دالتون) و رسوب رو با اتانل بدون آب شستند و بعد در آب حل کرده و لیوفیلیزه کردن تا پلیساکاریدهای محلول در آب سرد (مقدار ۵/۸ گرم) با سانتریفوژ جمع شن(دمای ۲۰ درجه سانتی‌گراد زمان ۱۰ دقیقه و سرعت rpm3000).
۲-۴ هیدرولیز پلی‌ساکاریدها:
در مقاله “سیلوا و همکاران” هیدرولیز پلیساکاریدهای دیواره سلولی پوست پرتقال رو به روش زیر انجام دادن:
منوساکاریدها رو از پلیساکاریدهای دیواره سلولی با یه مرحله هیدرولیز اولیه طبق روش Selvendran و همکاران آزاد کردن.
۲ میلی‌گرم از جزء نامحلول در الکل و ۲۰۰ میکرولیتر از H2SO4(molL-1 ۱۱) رو تو یه لوله عکس العمل‌گر پس از رقیق‌سازی به مدت ۳ ساعت در molL-11 اسیدهیدرولیز کردن و هیدرولیز به مدت ۵/۲ ساعت در ۱۰۰ درجه‌سانتی‌گراد، دمای اتاق انجام شد. بعد واسه قطع عکس العمل در دمای اتاقمحلول رو خنک کردن و ترکیب هیدرولیز شده رو تبخیر کردن تا خشک شه (۵۴).
“لو و همکاران” پلیساکاریدهای چای رو به روش زیر هیدرولیز کردن:
۲۰ میلی‌گرم پلی‌ساکارید رو در ۲ میلی‌لیتر تریفلوئورواستیک اسید ۳ مولار حل کردن و آمپول در اتمسفر نیتروژن بسته شد و در حموم آب‌جوش نگهداری شد تا پلی‌ساکاریدها طی ۸ ساعت به اجزای منوساکاریدی تجزیه شن.
نمونه رو در دمای اتاق خنک کرده و ۵ دقیقه با دور rpm 1000 سانتریفوژ کردن. محلول رویی رو جمع‌بیاری وتحت فضای خالی خشک کردن. به محلول نمونه خشک و هیدرولیز شده، ۱ میلی‌لیتر آب مقطر اضافه کردن تا واسه آزمون آماده شه (۴۴).
روش بررسی قندهای صمغ چوبک در مقاله “جهان‌بین و همکاران “در سال ۲۰۱۲ به توضیح زیر بوده:
قند کل با روش فنل‌سولفوریک‌اسید اندازهگیری شد و با به کار گیری D-گلوکز به عنوان استاندارد در ۴۹۰ نانومتر و اسیدهای اورونیک با روش m- هیدروکسی‌دی‌فنیل با به کار گیری اسیدگالاکتورونیک به عنوان استاندارد اندازهگیری شدن.
هم اینکه در تحقیق “جهان بین و همکاران” هیدرولیز صمغ واسه اندازهگیری ترکیب قند به توضیح زیر انجام شد:
اونا محتوای قند رو طبق روش بنهورا(۲۰۰۲) با اصلاح کم اندازهگیری کردن. نمونه ۱۰ گرمی صمغ خشک شده انجمادی رو در ۱۲۰ درجه سانتی‌گراد برای۳ ساعت با ۱ میلی‌لیتر اسید تریفلوئورواستیک تو یه لوله در‌بسته گرما دادن. اسید اضافی با تبخیر سریع روی حموم آب تو یه دمای ۴۰ درجه سانتی‌گراد حذف شد و با آب (۳ برابر) تقطیر شد. محلول هیدرولیز شده رو با ۵۰ میلی‌گرم NaBH4 احیا کرده و با صافی فیلتری ۴۵/۰ میکرونی صاف کردن و ۰۲/۰ میلی لیتر از نمونه رو به ستون HPLC تزریق کردن (۳۸).
در مقاله “دوبیوس و همکاران” در سال ۱۹۵۶با عنوان رنگ‌سنجی واسه اندازهگیری قندها و ترکیبات وابسته اومده:
قندهای ساده ، الیگوساکاریدها، پلی‌ساکاریدها و مشتقات اونا شامل متیل‌اترها، قندهای احیاکننده و بالقوه با پیوندهای احیاکننده در تیمار با فنل و اسیدسولفوریک غلیظ رنگ زرد پرتقالی میدن. درنتیجه عکس العمل فنل- سولفوریک‌اسید یه روش پیشرفته واسه اندازهگیری مقادیر خیلی کم قندها و اجزای وابسته به اونا هستش. با پیوند با کروماتوگرافی کاغذی روش واسه اندازهگیری ترکیب پلی‌ساکاریدها و مشتقات اونا مناسبه (۲۹).
آزمون‌های رنگ‌سنجی واسه قندهای احیاکننده و پلی‌ساکاریدها از زمان‌های قدیم شناخته شده. معرف‌هایی همچون۱-نفتول واسه کلیه کربوهیدرات‌ها، بنزیدین واسه پنتوزها و اسیدهای اورونیک، نفتورزورسینول واسه اسیدهای اورونیک و رزورسینول، نفتورزورسینول و دی‌سولفونیک‌رزورسینول‌اسید واسه کتوز‌ها مثال‌های شناخته شده‌ای از آزمون‌های رنگ‌سنجی هستن که ممکنه در محلول اسیدی انجام شن. در این‌گونه آزمون‌ها و اصلاحات اونا، آمین‌ها و فنل‌های آروماتیک بکار می‌روند. پلی‌ا‌ُل‌ها و کربوهیدراتهای دارای گروه‌های احیاکننده ممکنه با معرف نقره تولنز[۱۶] ، جستجو شن؛که شاید یکی از بهترین معرفها در هنر کروماتوگرافی باشه. هم اینکه قندهای احیاکننده با اسیدپیکریک[۱۷]، O-دی‌نیتروبنزن و متیلن‌بلو جستجو می‌شن درحالیکه دی‌آزوراسیل مخصوص ساکارز و الیگوساکاریدها و پلیساکاریدهای دارای اجزای ساکارز هستن.
روش‌های حجم‌سنجی مثل کاربرد پتاسیم فری سیانید، سولفات سریک[۱۸] و سولفات مس و سدیم هیپویدات واسه اندازهگیری مقادیر کم قندهای احیاکننده پس از جداسازی با کروماتوگرافی کاغذی کاربرد دارن.
هرچند تجربه نشون داده‌است که این روش‌ها نیازمند مهارت قابل‌توجه هستن و زمان‌‌بر می‌باشن و در برابر تنوع مقادیر کم قند، حساس هستن.
معرف‌های آنترون و ۱-نفتوسولفونات واسه محلول‌های قندی استاندارد عالی هستن اما وقتی در بررسی‌های قندهای جدا شده با کروماتوگرافی کاغذی عمل میکنن حضور مقدار کمی از ترکیبات پیشرفت‌دهنده حلال ممکنه اونا رو غیرقابل استفاده کنه.
بیشتر قندها با یه صافی کاغذی و با یه حلال فنل-آب قابل جداسازی هستن اما بعد با معرف آنترون قابل اندازهگیری نیستن چون فنل باقی‌مونده در کاغذ به‌شدت در رنگ سبز تولید شده با معرف آنترون دخالت می‌کنه. هم اینکه معرف آنترون گرانه و محلول‌های اون در اسیدسولفوریک پایدار نیستن. روش آنترون با اینکه واسه قندهای آزاد و گلیکوزیدهای اونا رضایتبخشه واسه قندهای متیله شده و پنتوزها کاربرد محدودی داره. هرچند حلال بوتانل-اسیدپروپیویک-آب یه حلال عالی واسه جداسازی دی‌ساکاریدهاه؛ اسیدپروپیونیک باقی‌مونده با روش ۱-نفتوسولفونات دخالت‌گره. آنیلین‌فتالات و آنیلین‌تری‌کلرواستات واسه اندازهگیری رنگ‌سنجی قندها و مشتقات اونا سازماندهی شده‌ان. این معرفها واسه کتوز‌ها بد هستن.
فنل در حضور اسیدسولفوریک واسه اندازهگیری رنگ‌سنجی اندازه‌های میکرونی قندها و مشتقات متیله اونا، الیگوساکاریدها و پلی‌ساکاریدها بکار می‌روند. این روش خصوصا واسه اندازهگیری مقادیر کوچیک قندهای جداشده با کروماتوگرافی کاغذی با حلال فنل-آب و هم واسه قندهایی که فرار هستن مثل بوتانل-اتانل-آب، اتیل‌استات-اسیداستیک-آب یا متیل‌اتیل‌کتون-آب مناسب هستن. روش، ساده، سریع و حساسه و یافته های تکرارپذیر می‌دهد. معرف ارزون و پایداره و محلول حاصل فقط یه منحنی استاندارد واسه هر قند لازم داره. رنگ تولید شده پایداره و نیازمند توجه خاصی واسه کنترل شرایط آزمون نیس.
جذب رنگ زرد پرتقالی واسه هگزوز‌ها در ۴۹۰ نانومتر و واسه پنتوزها و اسیدهای اورونیک در ۴۸۰ نانومتر اندازهگیری می‌شه (۲۹).
هم اینکه، واسه گرفتن منوساکاریدهای ترکیبات حاصل از پلیساکاریدهای مالوا نگلکتا ایلجین در سال ۱۹۸۹ “لیگای و همکاران” ترکیبات استخراج شده رو با اسیدسولفوریک ۲ نرمال در ۱۰۰ درجه سانتی‌گراد و به مدت ۴۸ ساعت هیدرولیز کردن (۴۲).
در کتاب پروتوکل گذشته شیمی مواد غذایی نوشته “فورنیه” در سال ۲۰۰۱ تعیین مقدار کربوهیدرات‌ها به روش رنگ‌سنجی اینجوری توضیح داده شده:
اندازهگیری قندهای احیاکننده و غیراحیاکننده با به کار گیری راه فنل‌سولفوریک اسید واسه تعیین مقدار قند محیط بکار میره. درحالیکه قند همراه با شکلای جور واجور نمک‌ها و اجزای پروتئینیه یا وصل به یه پلی‌مر می‌باشه؛ می‌توان از راه فنل‌سولفوریک استفاده کرد. به جز واسه قندهای داکسی، این روش واسه بقیه قندها بسیار معموله و می‌تونه واسه قندهای احیاکننده و غیراحیاکننده و واسه گروه‌های کربوهیدراتی شامل الیگوساکاریدها بکار رود (۳۲).
اندازهگیری قندها با روش فنل‌سولفوریک براساس تشکیل یه کمپلکس آروماتیک رنگی بین فنل و کربوهیدرات در طول موج ۴۹۰ نانومتر می‌باشه. اندازهگیری مقدار قند موجود در مقایسه با منحنی کالیبراسیون با به کار گیری یه اسپکتروفتومتر صورت می‌گیرد. دقت روش فنل‌سولفوریک‌اسید ±۲% است.
اگه اسپکتروفتومتر در دسترس نباشه روش رو می‌توان به صورت کیفی با مقایسه مستقیم چشمی با رنگ نمونه که غلظت مشخص داره انجام داد.
محلول فنل در آب تا ۶ ماه در دمای اتاق قابل نگهداریه.
سلولز می‌تونه در نتیجه آزمون دخالت کنه پس از تماس غبار کاغذ باید جلوگیری شه (۳۲).
“زای و همکارانش” در سال ۲۰۱۰، اندازهگیری پلیساکاریدهای چای در کاملیا سیننسیس با یه روش اصلاح شده فنل‌سولفوریک‌اسید رو تحقیق کردن.
روش مستقیما واسه اندازهگیری کربوهیدرات کل در کاملیا سیننسیس برپایه روش فنل سولفوریک اصلاح شده استفاده شد. بعد ترکیب منوساکارید حاصل از کربوهیدرات کل در چای بروش گازکروماتوگرافی بررسی شد.
شرایط آزمایشگاهی شامل حجم فنل، حجم اسیدسولفوریک غلیظ، زمان عکس العمل و دمای گرم خونه‌گذاری تنظیم شد. در حجم اسیدسولفوریک غلیظ ۵/۲ میلی‌لیتر، حجم فنل۶%، ۲/۰ میلی‌لیتر و دمای گرمخانه‌گذاری ۵۰ درجه سانتی‌گراد، بالاترین حساسیت بدست اومد. تحت این شرایط بازیافت نمونه از ۲/۱۰۰ تا ۷/۱۰۳ با انحراف‌ملاک ۵/۰% بود. جذب در ۴۸۰ نانومتر انجام شد (۶۳).
“۲۷” واسه اندازهگیری کیفی همزمان منوساکاریدهای شامل فروکتوز در هیدرولیزهای اجناس ماست و آب پرتقال به روش زیر عمل کردن:
آب‌پرتقال با فیلترغشایی mµ۴۵/۰ صاف شد. محلول صاف شده با H2SO4 یه مولار در ۸۵ درجه سانتی‌گراد واسه ۶ ساعت هیدرولیز شد و با NaOH 5/0 مولار خنثی شد.
هم اینکه ماست در سرعتrpm 20000 واسه نیم ساعت سانتریفوژ شد و با صافی غشایی mµ۴۵/۰ واسه حذف ذرات جامد صاف شد. محلول صاف شده با H2SO4 یه مولار در ۸۵ درجه سانتی‌گراد واسه ۶ ساعت هیدرولیز شد و با NaOH 5/0 مولار خنثی شد. حجم اولیه و پایانی نمونه‌ها اندازه گیری شد.
هیدرولیز کامل اسیدی طبق روش استفاده شده در مقاله” کانگ و زیا “به توضیح زیر بوده:
۲۰ میلی‌گرم ازنمونه پلی‌ساکارید رو در ۲ میلی‌لیتر از آمپول تریفلوئورواستیک اسید(TFA) حل کردن. آمپول تحت شرایط اتمسفر نیتروژن و در حموم آب‌جوش به مدت ۱۰ ساعت نگهداری شد تا پلی‌ساکارید واسه تبدیل به اجزایش منوساکاریدها هیدرولیز شه. پس از خنک شدن در دمای اتاق، مخلوط عکس العمل رو به مدت ۵ دقیقه و دور rpm 1000، سانتریفوژ کردن. مایع روییرا جمع‌بیاری وتحت فضای خالی خشک کردن. نمونه محلول هیدرولیز و خشک شده رو به ۱ میلی‌لیتر آب‌مقطر اضافه کردن تا واسه تحقیق آماده شه (۴۰).
“ماسوکو و همکاران” در سال ۲۰۰۵، اندازهگیری کربوهیدرات به روش میکروپلیت رو با فنل سولفوریک اسید انجام دادن. در این مقاله اومده‌است: در میان روش‌های رنگ سنجی واسه بررسی کربوهیدرات‌ها، روش فنل سولفوریک آسون‌ترین و قابل اعتمادترین روشه (۴۵).
این روش واسه اندازهگیری قندهای خنثی در الیگوساکاریدها، پروتئوگلیکان‌ها و گلیکوپروتئین‌ها و گلیکو‌لیپیدها بکار می‌رود و به دلیل سادگی و حساسیت بسیار کاربرد داره. در حالت عادی نیازمند ۵۰ تا ۴۵۰ نانومول منوساکارید یا برابر اون واسه آنالیزهاه پس واسه نمونه‌های مهم کفایت نمی‌کنه.
یه نسخه با مقادیر کم شده که فقط نیازمند ۱۰-۸۰ نانومول قند بود قبلا گزارش شده. در این روش آزمون طوری تنظیم شده که محدوده خطی در ۱-۱۵۰ نانومول واسه مانوز و حساسیت بالا بدست آید. سرعت و سادگی این روش اونو یه روش بسیار مناسب واسه آنالیزهای تعداد زیادی نمونه واسه آزمون‌های کروماتوگرافی می‌کنه.
آزمون روی زمان هم‌زدن (۰ تا نیم ساعت)، حجم اسیدسولفوریک غلیظ(۰ تا ۱۵۰ میلی‌لیتر) و حجم فنل ۵%(۰تا ۱۰۰ میلی‌لیتر) تمرکز داشت.
حجم مانوز رو ۵۰ میکرولیتر در نظر گرفتن. دمای آزمون رو ۹۰ درجه سانتی‌گراد و زمان گرمادهی رو ۵ دقیقه تعیین کردن.
در مقاله “فدوی و همکاران” در سال ۲۰۱۳ که روی ترکیبات و خصوصیات صمغ زدو تراویده از درخت بادام کوهی هم کربوهیدرات کل رو به روش فنل سولفوریک اندازهگیری کردن. مقدار کربوهیدرات کل در نمونه‌های سفید صمغ زدو رو ۴/۹۸%، در نمونه‌های زرد ۱/۹۳% و در نمونه‌های قرمز ۱/۹۵% تعیین کردن (۳۱).
۲-۵ جداسازی منوساکاریدها:
در تحقیق” لو و همکاران” در سال ۲۰۰۹، جدا سازی با PMP (فنیل متیل پیرازولون) انجام شد. فنیل‌متیل‌پیرازولون با کربوهیدراتهای احیاکننده تحت شرایط ملایم عکس العمل می‌دهد و نیاز به کاتالیست اسیدی نداره و باعث ایزومریزاسیون و دسیلاسیون نمی‌شه.
اونا به هر۱۰ منوساکارید (استاندارد یا نمونه هیدرولیز شده) محلول آبیNaOH 3/0 مولار (۵۰ میکرولیتر) و محلول متانوله ۵/۰ مولار PMP (50 میکرولیتر) اضافه کردن. اینطوری PMP با NaOH خنثی گردید.
دانلود مطالب پژوهشی در مورد اندازه گیری منوساکاریدهای لعاب گیاه مالوا نگلکتا- فایل ۲
