۳-۱۸-۱- تعداد نمونه
تعداد ۷۸نمونه سرم ( هر سرم از یک فرد) از زنان باردار که دچار علائم بالینی شده و به آزمایشگاه مراجعه کرده و با انجام آزمایشات استاندارد مبتلا به توکسوپلاسما تشخیص داده شدند. Cutoff با بهره گرفتن از جذب نوری۱۰ سرم منفی ( بدون عفونت توکسوپلاسما) و به صورت mean+2SD برای IgG ELISA برابر ۰.۲ تعیین شد.

۳-۱۸-۲- روش نمونه گیری:
در این بررسی برای نمونه گیری ، با داشتن معرفی نامه به آزمایشگاه های تشخیص طبی شهر تهران مراجعه و نمونه های حاد و مزمن توکسوپلاسما آنها اخذ و به آزمایشگاه انگل
شناسی انستیتوپاستور منتقل و آزمایشات تکمیلی به منظور رده بندی آنها به حاد ومزمن انجام می شد.
در این روش نمونه گیری به علت اینکه ارتباط مستقیم با بیماران نداشتیم ، ملاحظات اخلاقی خاصی مورد نیاز نبود.
فصل چهارم
نتایج آزمایشات
۴-۱ :تهیه و تخلیص پروتئین های نو ترکیب rGRA7 (pUET-GRA7) و rGRA6(PUET-GRA6)

در تخلیص پروتئین معمولا از چندین روش کروماتوگرافی و در هر مرحله از یک خصوصیت فیزیکو شیمیایی پروتئین استفاده می شود. در مرحله اول تخلیص پروتئین از یک روشی capturing استفاده میشود که به صورت انتخابی پروتئین مورد نظر را از عمده پروتئین های دیگر جدا میکند. روش کروماتوگرافی تمایلی با بهره گرفتن از رزین نیکل که بر اساس افینیته بسیار بالای دنباله هیستیدینی و نیکل عمل میکند و نیز روش کروماتوگرافی تعویض یونی که بر اساس میزان بار یونی سطح پروتئین عمل میکند دو روش capture قوی هستند.
به منظور تهیه و تخلیص پروتئین های نو ترکیب rGRA7 (pUET-GRA7) و rGRA6(PUET-GRA6)، کشت باکتریایی به حجم ۵۰۰ میلی لیتر تهیه و پس از القاء رسوب باکتریایی جمع آورده شد . باکتریها توسط بافر لیز کننده لیز شدند و پروتئین های rGRA7 و rGRA6 با روش کروماتوگرافی تمایلی با بهره گرفتن از رزین NI-NTA تخلیص شدند. مراحل تخلیص روی ژل SDS-PAGE بررسی گردید. (۴-۱ و ۴-۲).
۱ ۲ ۳ ۴ ۵
BI AI P S M
شکل ۴-۱ : تخلیص پروتئین GRA6 به روش کروماتوگرافی تمایل ستونها : ۱- نمونه قبل از القاء ۲- نمونه بعد از القاء ۳- پلت حاوی پروتئین نامحلول ۴- سوپ حاوی پروتئین محلول ۵ - شاخص اندازه ملکول
۱ ۲ ۳ ۴ ۵

M B AI S P
شکل ۴-۲: تخلیص پروتئین GRA7 به روش کروماتوگرافی تمایلی ستون ۱: شاخص اندازه ملکولی. ستون ۲:نمونه قبل از القاء. ستون ۳: نمونه بعد از القاء. ستون ۴: مایع روییحاوی پروتئین محلول. ستون ۵: رسوب حاوی پروتئین نامحلول. باند سیاه قابل مشاهده در پایین عکس، مربوط به لیزوزیم است.
۴-۲- تایید هویت پروتئین های تخلیص شده با روش وسترن بلات
به منظور تایید پروتئین های بیان شده GRA7 و GRA6 برای آنها وسترن بلات گذاشته شد.همانطور که در شکل مشاهده می شود وسترن بلات بر علیه سه گروه سرم منفی ،حادو مزمن انجام شد و در استریپ سرمهای حاد باند قهوه ای پر رنگ روبروی ۳۷ و ۴۱ کیلودالتون) بترتیب برای روبروی GRA7 و GRA6) مشاهده می شود که به منزله اثبات آنتی ژنیسیته پروتیین های بیان شده بوده و با توجه به شدت باند در استریپ سرم های حاد ، نشانگر این است که این آنتی ژن ها مارکرهای فاز حاد عفونت میباشند.
شکل ۴-۳: بررسی هویت آنتی ژنیسته پروتئین های GRA6 وGRA7 تخلیص شده با روش وسترن بلات
۴-۳- بررسیIgG,IgM,IgG Avidity نمونه های سرمی با کیت استاندارد Euroimmun
IgM ایمونوگلوبولینی است که معمولا” در آغاز عفونت ترشح شده در پایان هفته دوم عفونت به حد اکثر مقدار خود رسیده و از هفته چهارم بتدریج مقدار آن کم شده و در آخر ماه دوم خیلی کم است ، بنابر این بعنوان یک مارکر فاز حاد عفونت بحساب می آید.
IgG ایمونوگلوبولینی است که معمولا” دو هفته بعد از آغاز عفونت ترشح شده در پایان ماه دوم عفونت به حد اکثر مقدار خود رسیده و از پایان ماه چهارم مقدار آن کمتر شده و تا مدتها بعد از عفونت در بدن تولید می شود ، بنابر این بعنوان یک مارکر فاز مزمن عفونت بحساب می آید.
IgG Avidity نیروی چسبندگی بین ملکولهای آنتی بادی و اپی توپهای آنتی ژن است که هر چه از آغاز عفونت گذشته باشد و با گذشت زمان مقدار آن بیشتر می شود بطوریکه عفونت های حاد دارای آویدیته پائین و عفونت های مزمن دارای آویدیته بالا می باشد.
اساس دسته بندی این اطلاعات وقرار دادن نمونه سرم ها در سه فاز مختلف بیماری مرحله حاد بیماری،مرحله تحت حاد بیماری ومرحله مزمن آن در زیر آمده است:
مشخصه سرم های حاد دراین بیماری: مشخصات سرمها دارای آنتی بادی های IgM و IgG مثبت وهمچنین دارای مشخصه اویدیتی (AI) پائین(سرم هایی با اندکس اویدیته کمتر از ۴۰%) با کیت Euroimmun IgG Avidity بوده اند.
مشخصه سرم های تحت حاد در این بیماری : مشخصات سرمها دارای آنتی بادی های IgM و IgG مثبت وهمچنین دارای مشخصه اویدیتی(AI ) بالا(سرم هایی با اندکس اویدیته بالاتر از ۶۰%) با کیت Euroimmun IgG Avidity بوده اند.
مشخصه سرم های مزمن در این بیماری:این خصوصیات تشخیصی این مرحله از سرم ها میباشد IgM منفی ، IgG مثبت و همچنین دارای اویدیتی ایندکس ( AI)بالا با کیت Euroimmun IgG Avidity میباشد.
۴-۳-۱- نتیجه آزمایشات IgG ELISA مخصوص توکسوپلاسما سرمهای ایرانی با کیت Euroimmun
به منظور دسته بندی سرمها به فاز حاد یا مزمن لازم است که وضعیت IgG ضد توکسوپلاسمایی آنها مشخص شود ، بدین منظور سرمهای جمع آوری شد
ه را از نظر IgG با روش ELISA و با کیت Euroimmun بررسی شد.
همانطور که در جدول ۳-۱ مشاهده میشود ، تعداد۷۸سرم که در آزمایش IgG ELISA مثبت تشخیص داده شدند، لیست شده اند.
۴-۳-۲- نتیجه آزمایشات IgM ELISA مخصوص توکسوپلاسما سرمهای با کیت Euroimmun
تعداد ۷۸نمونه سرم از زنان حامله ای که دارای علائم بالینی و یا مشکوک به بیماری توکسوپلاسموز بوده جهت انجام آزمایش به آزمایشگاههای تشخیص طبی مراجعه کرده بودند جمع آوری و برای آنها آزمایش IgM ELISA با کیت Euroimmun که یک کیت معتبر اروپایی است گذاشته شد.
همانطور که در جدول ۴-۱ مشاهده می شود تعداد ۵۰ سرم ، که با آزمایش ELISA IgM مثبت تشخیص داده شده و تعداد ۲۸ سرم که IgM منفی بودند، آورده شده اند.
۴-۳-۳-نتیجه آزمایشات IgG Avidity ELISA مخصوص توکسوپلاسما سرم ها با کیت Euroimmun
جدول شماره ۳-۱ نتیجه آزمایشات IgG Avidity ELISA را با کیت Euroimmun نشان می دهد. طبق اطلاعات جدول ۵۷ سرم دارای آویدیته بالای ۶۰% و۲۱ سرم دارای آویدیته پایین ۴۰% بودند و سرم هایی که دارای آویدیته متوسط (Borderline) باشند در مطالعه وجود نداشت. بنابرین ۲۸ نمونه از سرم ها در فاز مزمن و ۲۱ نمونه در فاز حاد و ۲۹ نمونه در فاز تحت حاد طبقه بندی میشوند. (جدول ۴-۱).
جدول ۴-۱: نتایج آزمایشات Avidity ELISA,IgG,IgM سرم ها با کیت Euroimmon